关于2,3吲哚醌诱导人神经母细胞瘤细胞凋亡作用及机制

【摘要】 目的 观察2，3吲哚醌（ISA）经Caspase3途径诱导人神经母细胞瘤凋亡的作用及机制。方法 以不同浓度ISA（0、100、200、400 μmol/L）作用于SHSY5Y细胞48 h，采用Hocehst33258/PI荧光染色技术观察细胞凋亡的形态学改变，流式细胞术检测细胞凋亡率的变化，Western blot方法检测Caspase激活的脱氧核糖核酸酶抑制剂（ICAD）蛋白表达的变化。结果 Hochest33258/PI荧光染色可见核浓缩及核碎裂等典型的细胞凋亡形态学特征。100、200、400 μmol/L ISA处理组SHSY5Y细胞的凋亡率均明显高于对照组（F=111.30，P&<0.05）。随着ISA浓度的升高，表达活化Caspase3的细胞数逐渐增加（F=5.622，P&<0.05）。Western blot检测到其下游作用底物ICAD被降解。结论 ISA能诱导SHSY5Y细胞凋亡，该作用可能通过激活Caspase3来实现。
【关键词】 吲哚醌类 神经母细胞瘤 细胞凋亡
　　［ABSTRACT］ Objective To explore the effects and mechanisim of caspase3 activation in ISAinduced apoptosis of human neuroblastoma cell line SHSY5Y through caspase3 pathway. Methods The apoptosis was detected by flow cytometry (FCM) and Hochest33258/PI staining， and the activity of caspase3 determined by FCM. Western blot was used to analyze inhibitor of caspaseactivated DNAse (ICAD)， the substrate of Caspase3 after treatment of ISA at different concentrations (0， 100， 200， 400 μmol/L). Results The morphological features of nuclear condensation and fragmentation were observed after exposure to 400 μmol/L of ISA. The apoptotic rate of SHSY5Y cells， after treatment with ISA (100， 200， 400 μmol/L)， was significantly higher than that in the control. The activation of caspase3 increased with an elevation of ISA density (F=5.622，P&<0.05). Inhibitor of caspaseactivated DNase (ICAD) protein， the substrate of Caspase3， was degraded. Conclusion Isatin could induce apoptosis of SHSY5Y cells， which， probably， is completed through the activation of caspase3.
　　［KEY WORDS］ Indolequinones; Neuroblastoma; Apoptosis
　　2，3吲哚醌（ISA）是维持龙虾生存所必需的一种内源性吲哚，是我国独创Ⅰ类抗癌药物——靛玉红的先导化合物。ISA是成分单一的有机天然物质，化学结构明确，毒性低，副作用小， 对正常细胞有保护作用，有促进人和小鼠神经母细胞瘤细胞凋亡的作用[1]。课题组的前期实验已经证明，ISA可以通过影响靶细胞生长周期和下调血管内皮生长因子（VEGF）的作用进而达到抑制肿瘤细胞生长的作用[2，3]。本文将在上述研究的基础上进一步探讨ISA诱导SHSY5Y细胞凋亡的作用及机制，同时观察Caspase3活化情况。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要试剂
　　ISA购自上海元吉化工有限公司，DMSO溶解，母液浓度为5 mmol/L，4 ℃保存，实验时用无血清培养基稀释至实验浓度（DMSO的体积分数&<0.01%）。脱氧核糖核酸酶抑制剂（ICAD）和βactin的抗体购自北京博奥森公司； ECL发光试剂购于北京普利莱公司；藻红蛋白（PE）结合的单克隆活化的Caspase3抗体凋亡试剂盒(PEconjugated monoclonal active Caspase3 antibody apoptosis KIT) 购自BD PharMingen公司；Hochest33258、碘化丙啶(PI)购自美国Sigma公司。
　　1.2 细胞株及其培养
　　SHSY5Y细胞株购自中国协和基础学院细胞中心，用含体积分数0.15胎牛血清（杭州四季青生物公司）的HDMEM培养基(GIBCO公司产品)，在含体积分数0.05 CO2、37 ℃饱和湿度条件下培养。
　　1.3 荧光染色
　　取对数生长期的SHSY5Y细胞，以107/L的密度接种于培养瓶中，培养24 h后，加入ISA，随机分为对照组（不含ISA）及不同浓度的ISA处理组（100、200、400 μmol/L），收集细胞于1.5 mL 的EP管中，用冷的PBS漂洗2次，离心去上清后，每管中均加入Hochest33258、PI染液使其终浓度分别为40 mg/L和50 mg/L，37 ℃避光孵育30 min，取出细胞悬液20 μL 滴于载玻片上，盖上盖玻片，紫外线激发，进行拍照。实验重复3次。
　　1.4 PI染色、流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化
　　收集对照组（不含ISA）及不同浓度（100、200、400 μmol/L）ISA处理组细胞，PBS洗涤2次后，PBS重悬，缓慢注入预冷的体积分数0.70乙醇中，30 ℃固定24 h以上，1 000 r/min离心5 min，去除乙醇，PBS清洗1 次，离心弃去PBS，加50 mg/L PI(含10 mg/L RNaseA) 0.5 mL于避光处染色30 min，用流式细胞仪进行检测。实验重复3次。用亚G1期的细胞比率表示细胞凋亡率。
　　1.5 流式细胞术检测表达活化的Caspase3细胞
　　4 ℃收集对照组（不含ISA）及不同浓度（100、200、400 μmol/L）ISA处理组细胞，PBS洗涤2次后，PBS重悬，逐滴注入预冷的40 g/L 多聚甲醛中固定30 min，离心去上清，PBS漂洗。加入体积分数0.001 Tritonx100室温孵育20 min，离心去上清，加入PE结合的单克隆活化Caspase3抗体避光室温孵育30 min，过筛后流式细胞仪检测。标记了PE的抗体只与活化的Caspase3结合，不与酶原形式的Caspase3结合，应用流式细胞仪即能分辨出表达活化的Caspase3细胞。实验重复3次。
　　1.6 Western blot检测Caspase3底物的变化
　　4 ℃收集对照组（不含ISA）及不同浓度（100、200、400 μmol/L）ISA处理组细胞于1.5 mL的EP管中，PBS洗涤2次后，每管中加入150 μL细胞裂解液在冰上裂解30 min，4 ℃下以12 000 r/min 离心5 min，收集上清液， 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。蛋白质样品与上样buffer按4∶1混匀，煮沸3 min。每孔上样40 μg， 120 g/L 的SDSPAGE胶分离样品。于室温恒流40 mA (1.5 h)将蛋白转至PVDF膜上，用50 g/L 的脱脂奶粉（溶于TBS)室温封闭2 h，将膜与溶于一抗稀释液(10 g/L 脱脂奶粉， 溶于TBS中)中的一抗 (兔抗人βactin抗体1∶300；兔抗人ICAD抗体)封于塑胶袋中，4 ℃过夜，室温孵育2 h，TBST洗15 min共3次，将膜与溶于二抗稀释液(10 g/L 脱脂奶粉，溶于TBS中)中的二抗室温孵育3 h，TBST洗15 min共3次，将膜包在保鲜膜中，加入ECL发光试剂，暗室暴光，显影，定影，对X线底片进行扫描，对结果进行吸光度分析。实验重复3次。
　　1.7 统计学处理
　　采用SPSS 11.5统计学软件进行数据处理，数据间比较采用单因素重复测量方差分析。
　　2 结 果
　　2.1 凋亡细胞形态学变化
　　400 μmol/L ISA处理组在荧光显微镜下观察到典型的凋亡形态学改变：细胞质浓缩、核染色质聚集。而对照组细胞核呈均匀的蓝色荧光。
　　2.2 细胞凋亡率
　　100、200、400 μmol/L的ISA均可诱导SHSY5Y细胞发生凋亡，细胞凋亡率随药物浓度增加而增加，分别为（7.99±0.10）%、（17.83±1.65）%和（18.20±1.23）%，对照组为（2.78±0.04）%，不同浓度ISA处理组与对照组比较，差异有显著性（F=111.30，P&<0.05)。
　　2.3 活化的Caspase3表达
　　经0、100、200、400 μmol/L ISA处理SHSY5Y细胞48 h，表达活化的Caspase3的细胞数随着药物浓度的增大逐渐增多，表达未活化的Caspase3的SHSY5Y细胞数则逐渐减少（F=5.622，P&<0.05）。见表1。表1 不同浓度ISA作用SHSY5Y细胞后活化Caspase3变化(略)
　　2.4 Caspase3底物ICAD蛋白的变化
　　对照组细胞表达一定量的ICAD蛋白，用不同浓度ISA处理SHSY5Y细胞48 h，随着药物浓度的增加ICAD的表达量逐渐降低（图1）。　
　　3 讨 论
　　神经母细胞瘤是儿童常见恶性肿瘤，恶性程度高。虽然近年来不断出现新的化疗药物，但神经母细胞瘤病人的无瘤生存率仍然很低，再加上化疗药物本身毒性很高，寻找新一代低毒高效的抗癌药物是国内外研究者所期待的。近几年来，天然的吲哚类化合物因为毒性低而引起人们的关注，并迅速成为抗癌药物研究的热点。目前，ISA单独作用于神经母细胞瘤研究还未见报道。本实验选用人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株作为靶细胞株，研究新型抗肿瘤化合物ISA诱导凋亡的作用机制。

　　细胞永生化是肿瘤形成的一个重要原因，而细胞凋亡失控又是造成细胞永生化的直接原因。因此，抑制肿瘤细胞生长的机制，主要是诱导肿瘤细胞凋亡，而Caspase和Bcl2 家族蛋白与细胞凋亡密切相关[4]，尤其是bcl2/bax降低，可引起线粒体膜电位的改变[5]，进一步激活Caspase3诱导细胞发生凋亡。有研究报道，Caspase3在神经母细胞瘤中高度表达，并且其高度表达可以诱导神经母细胞瘤凋亡[6，7]。本课题组以往研究显示，ISA作用于SHSY5Y细胞后，抗凋亡基因bcl2 mRNA表达明显下降，促凋亡基因bax未发现明显改变，bcl2/bax降低[8]。在凋亡的信号传递中，Caspase3处于凋亡诱导信号传递、Caspase3级联反应、下游效应因子作用这一凋亡过程中的中心位置，它是细胞程序性死亡的最终执行者。激活的Caspase3可以水解包括细胞调节、细胞信号传导、DNA修复等环节中重要的蛋白，从而使细胞表现为凋亡特有的形态学及生化特征。在正常情况下，Caspase3是以无活性的酶原形式存在于细胞浆中，只有当Caspase3被上游的Caspase激活后，才能生成活化Caspase3亚基，同时水解其下游的底物，最终有规律地切断DNA。本实验通过荧光染色观察到，400 μmol/L ISA组细胞出现典型的凋亡形态学改变：胞体缩小，细胞质浓缩，核染色质聚集，并有DNA碎片； SHSY5Y细胞经0、100、200、400 μmol/L ISA处理后，DNA直方图上出现明显的亚G1峰，凋亡率逐渐增加，呈明显的浓度依赖性。另外，本实验用流式细胞仪检测Caspase3的活化率，Western blot检测其下游底物的改变，结果显示，表达活化的Caspase3的细胞数随药物浓度的升高逐渐增加，而其下游作用底物ICAD的蛋白表达量逐渐下降。由此推测，ISA作用于SHSY5Y细胞可能通过降低Bcl2/Bax比值来改变线粒体膜电位，启动细胞色素C的释放，细胞色素C与Caspase9、Apaf1结合形成复合物，激活Caspase9，最终将信号传导到下游的Caspase3，促进Caspase3活化，触发凋亡。
　　综上所述，ISA在诱导SHSY5Y细胞凋亡的过程中，激活Caspase3，活化的Caspase3对凋亡的发生及调节发挥着重要作用。但是，肿瘤的形成是多因素作用的结果，而抑制肿瘤细胞增殖的机制也是多方面的，因此ISA的抗癌机制有待于进一步研究。

参考文献

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