作者：陈瑾歆 杨尚君 蒲宇 范建东
【摘要】目的 研究斑蝥酸钠对人宫颈癌Hela细胞凋亡相关基因BCL-2表达的影响。方法 采用Western blot法检测不同浓度斑蝥酸钠处理的Hela细胞中BCL-2基因表达的变化。结果 与空白对照相比，不同浓度斑蝥酸钠处理各组Hela细胞中BCL-2基因表达明显减少。结论 斑蝥酸钠可抑制Hela细胞凋亡相关基因BCL-2的表达。
【关键词】斑蝥酸钠 Hela细胞 凋亡
【Abstract】Objective:To detect the expression of BCL-2 in human cervical carcinoma cell line Hela treated with sodium cantharidina. Methods: The expression levels of BCL-2 were measured by Western blot in Helas treated with different concentration of sodium cantharidina. Results: Treatment with different concentration of sodium cantharidina. the expression of BCL-2 in Helas decreased significantly according to the cotrols. Conclusion: The expression levels of BCL-2 was degraded in Helas treated with sodium cantharidina.
【Key words】sodium cantharidina BCL-2 Hela
斑蝥具有攻毒蚀疮、破血散结的功效，临床多用于治疗肿瘤。斑蝥素(cantharidin，CTD)是斑蝥的有效成分，有良好的抗肿瘤作用，但毒性很强，因此人们合成了多种衍生物如斑蝥酸钠、甲基斑蝥胺等，这些衍生物毒性较低，与斑蝥素有类似的抗肿瘤作用[1]。斑蝥酸钠是（SCA）斑蝥素与氢氧化钠共热时水解生成，是一种广谱抗癌新药，对多种恶性肿瘤均有较好疗效，还有免疫调节作用，已应用于肿瘤的临床治疗，但其作用机制尚不明确，目前对其抗癌机理研究的报道甚少，认为可能机制是抑制肿瘤细胞的增殖或诱导肿瘤细胞凋亡[2，3]。本研究通过观察不同剂量的斑蝥酸钠对人宫颈癌Hela细胞凋亡相关基因BCL-2表达的影响，探讨斑蝥酸钠诱导Hela细胞凋亡的分子机制。
1 材料和方法
1.1 材料 人宫颈癌Hela细胞从中国科学院上海细胞所引进；斑蝥酸钠维生素B6注射液(贵州柏强制药有限公司)；RPMI1640培养基(美国Gibco公司)；一抗：BCL-2、抗GAPDH抗体（proteintech，USA）；HRP标记羊抗兔二抗（Abcam，USA）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和分组：Hela细胞以10%胎牛血清的RPMI1640培养基置于37℃、5%的CO2孵育箱中常规培养。取指数生长期细胞进行实验，血清饥饿法使细胞同步化，分别加入各处理条件的含有斑蝥酸钠培养液2ml，培养24h备用。实验分为正常对照组（control，n=5）、斑蝥酸钠处理高、中、低剂量组（5.0，2.5 ，1.0 mg/L，n=5）。
1.2.2 Western blot 细胞处理24小时后分组收集细胞，用预冷的PBS洗3遍，加入细胞裂解液冰上裂解30min，12000×g离心10min收集细胞总蛋白，定量调整蛋白浓度一致，加入上样缓冲液，100℃变性5min。蛋白样品经12%SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜，室温封闭2h，分别加入一抗：BCL-2（1∶800）、抗GAPDH抗体（1∶2000），4℃孵育过夜，TBST洗膜，加二抗（1∶7000）室温孵育2h，洗膜后加入ECL发光，常规显影，每个样本重复3次。BCL-2的表达水平以图像BCL-2与GAPDH的灰度比(BCL-2/GAPDH)表示，比值越大，BCL-2的表达水平越高。
1.2.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件， 数据以mean±SD表示，组间比较采用单因素方差分析，p&<0.05具有显著性差异。
2 结果
不同浓度的斑蝥酸钠对Hela细胞中BCL-2表达的影响见附表：与对照组相比，斑蝥酸钠高中低剂量组均受到明显抑制(P &<0.05)，并呈剂量依赖，随着斑蝥酸钠浓度的增加，斑蝥酸钠对BCL-2表达的抑制作用逐渐增强。结果提示低剂量组对Hela细胞BCL-2表达的抑制程度较低，中高剂量组抑制作用更为明显。
附表 各组细胞中BCL-2的表达(BCL-2/GAPDH，x±s， n=5）
组别 剂量mg/L BCL-2/GAPDH
正常对照组 0 0.162±0.015
斑蝥酸钠
低剂量组 1.0 0.144±0.008 1)
中剂量组 2.5 0.104±0.0101，2)
斑蝥酸钠
高剂量组 5.0 0.086±0.009 1，2，3)
与对照组比较 1)p&<0.01，与低剂量组比较 2)p&<0.01， 与中剂量组比较 3)p&<0.05。
3 讨论
有研究表明，斑蝥酸钠可以诱导多种肿瘤细胞凋亡[3，4]，细胞凋亡主要依赖三种信号转导途径[5]，线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置，线粒体依赖凋亡途径主要是凋亡刺激信号引起细胞损伤后，细胞色素c从线粒体释放，引发线粒体内凋亡分子Caspases 级联反应，最终诱导细胞产生凋亡。细胞线粒体细胞色素C等凋亡分子的释放受凋亡相关基因的调控，Bcl-2家族是了解较深入的与细胞凋亡调控有关的基因。目前认为绝大多数凋亡信号最终都通过Bcl-2蛋白家族与线粒体联系。Bcl-2家族即细胞淋巴瘤/ 白血病-2基因，是研究最早的与凋亡有关的基因，在细胞凋亡的线粒体途径中起重要调控作用。Bcl-2家族中Bcl-2、Bcl-xl等为抗凋亡蛋白，而BAX等为促凋亡蛋白，Bax和Bcl-2为同源蛋白，两者通过不同比例形成同/异二聚体来调节细胞凋亡，控制着上游凋亡信号进入线粒体[6，7]。斑蝥酸钠诱导Hela细胞凋亡的分子机制研究目前少有报道，有研究表明：斑蝥酸钠对Hela细胞生长有明显抑制杀伤作用，可诱导Hela细胞凋亡，达到治疗肿瘤的目的。本研究采用Western blot法检测凋亡相关基因BCL-2的表达，结果提示：斑蝥酸钠处理Hela细胞后，可明显抑制凋亡相关基因BCL-2的表达，随着斑蝥酸钠浓度的增加，斑蝥酸钠对Hela细胞中BCL-2表达的抑制作用逐渐增强，且中高剂量组抑制作用更为明显。实验结果提示斑蝥酸钠可能通过对凋亡相关基因的调节诱导促进细胞凋亡。
总之，斑蝥酸钠可明显抑制凋亡相关基因BCL-2的表达，且中高剂量组抑制作用更为明显，其与BAX家族成员协同作用的分子机制还有待于进一步的研究。
参 考 文 献
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