贴壁生长与悬浮生长树突细胞的免疫学功能比较

　　　　　　 作者：刘朋飞 朱磊 李响 葛超卓 周余来

【摘要】 　　目的 探索树突细胞（DCs）的可能生长状态，比较分析不同生长状态DCs的免疫学功能。方法 从正常人外周血分离获得单个核细胞，用不同培养介质常规培养2 h，取贴壁细胞，用含细胞因子的培养液进行培养，在培养过程中光镜下对其进行形态鉴别，然后检测两种DCs促淋巴细胞增殖和诱导免疫反应的功能。结果 7 d后，培养瓶中DCs基本处于悬浮状态，而培养板中DCs基本处于贴壁状态；培养瓶中DCs与培养板中DCs形态与理论相符，但培养板中DCs分化形态优于培养瓶中DCs。而在体外促进淋巴细胞增殖及体外诱导免疫反应方面，培养瓶中DCs的能力优于培养板中DCs。结论 在DCs体外培养至发育成熟的过程中，DCs先贴壁后悬浮的生长性质可能对其免疫学功能有着重要意义。

【关键词】 树突细胞；细胞培养；生长状态；免疫学功能

　　树突细胞（dendritic cells，DCs）是目前所知抗原呈递功能最强大，并且是惟一能激活初始性T细胞的抗原提呈细胞，所以，它是特异性免疫应答的始动者，在机体免疫应答中发挥着重要作用〔1，2〕。近年来，对于DCs的生物学特点及参与免疫应答的机制研究较多，由于老年人体内DCs抗原呈递功能下降，减弱了机体免疫防御及免疫监视作用，使老年人易患感染、肿瘤等多种疾病，所以，DCs在老年病研究中的地位越来越受到重视〔2〕。在体外进行DCs培养时，一般认为DCs贴壁生长一段时间后，会处于半贴壁或悬浮生长状态，所以在培养最后取悬浮细胞作为成熟DCs〔3～6〕。而不同培养介质所培养的DCs生长状态，国内外未见报道。本实验旨在探讨不同培养介质所培养DCs的生长状态，在形态和免疫学功能方面是否有所差异，为不同类型DCs的形态学和功能学鉴别提供重要依据，也为成熟DCs的分离培养方式提供一定的理论参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 重组人粒细胞

　　巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF）、重组人白细胞介素4（rhIL4）均购自美国Peprotech公司，重组人白细胞介素2（rhIL2）购自山东泉港药业有限公司，MTT购自美国GenView公司，二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶均购自美国Sigma公司，淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品有限责任公司，RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司，Rosettsep T细胞富集试剂盒购自加拿大Stemcell公司，人结肠癌colo205细胞株由吉林大学药学院生物工程实验中心提供，人外周血由健康志愿者提供。

　　EXL808酶标检测仪购自美国宝特公司，Olympus IX70倒置显微镜购自日本Olympus公司。

　　1.2 人外周血DCs的分离与培养

　　取健康志愿者外周静脉血40 ml，肝素抗凝，加入等体积PBS稀释后，经淋巴细胞分离液(Ficoll)梯度离心(2 000 r/min，20 min)；取界面细胞，置于15 ml离心管中，用PBS溶液悬浮细胞，1 500 r/min离心5 min；弃上清，如此反复洗涤细胞3次，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基悬浮细胞。以2.4×106个/ml的细胞浓度加入48孔培养板和培养瓶中，孵箱培养2 h；吸弃上清，用PBS洗2次，洗去非黏附细胞，获得贴壁细胞；再加入含有500 U/ml rhGMCSF和500 U/ml rhIL4的新鲜培养基，于37℃、5% CO2条件下培养。用含相同浓度细胞因子的培养基隔天半量换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长和形态。

　　1.3 肿瘤相关抗原的制备

　　培养一段时间后，取一定量结肠癌细胞用PBS洗涤3次，调整细胞浓度为2×107个/ml，分别于液氮与37℃水浴之间反复冻融3次；12 000 r/min离心30 min，收集上清液，用220 nm微孔滤膜过滤后，即为肿瘤相关抗原。于-70℃保存备用。

　　1.4 DCs的抗原负载

　　于DCs培养的第8天，用胰蛋白酶消化培养板中细胞，并进行细胞计数，接种到48孔板中。培养瓶中DCs处于悬浮状态，可直接计数。按DCs与抗原的比例为1∶5进行抗原负载，抗原加入量以冻融前肿瘤细胞的量计，并设置未进行抗原负载的对照组，观察抗原负载后DCs的生长状态。

　　1.5 静脉血T细胞的提取

　　取志愿者新鲜静脉血8 ml（用0.1%肝素抗凝），加入0.4 ml Rosettsep试剂（50 μl/ml静脉血）混匀室温静置20 min，PBS稀释后加入等体积的淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心20 min，吸出 T细胞层，再用PBS清洗2次，收集、备用。

　　1.6 DCs对T淋巴细胞的促增殖作用

　　在抗原负载48 h后，取T淋巴细胞，经台酚蓝染色后检测细胞活力，进行细胞计数，并调整细胞密度约为2×106个/ml；按一定比例，将T淋巴细胞加入到培养DCs的48孔板和培养瓶中。未进行抗原负载的对照组进行同样处理，于37℃、5%CO2条件下继续培养5 d。每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，续续培养4 h，弃去上清液，每孔再加入DMSO 200 μl震荡溶解颗粒。DMSO转入96孔板中，用波长490 nm酶标检测仪测定吸光度A值，计算刺激指数（SI），并比较不同生长状态的DCs对T淋巴细胞的促增殖作用。SI=实验组A值/对照组A值〔7〕。

　　1.7 体外诱导特异性CTL免疫反应

　　DCs抗原负载48 h后，加入T淋巴细胞，方法同1.6。实验组每孔加入浓度为2×104 U/L的rhIL2，继续作用5 d，用胰蛋白酶消化培养板内淋巴细胞并计数，培养瓶内细胞可直接计数。以结肠癌细胞为靶细胞，调整细胞浓度，并按靶效比1∶10的比例加入T淋巴细胞，于37℃、5% CO2条件下反应24 h。每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，续续培养4 h，弃去上清液，每孔再加入DMSO 200 μl震荡溶解颗粒，用波长490 nm酶标检测仪测定吸光度A值。

　　此处设效应细胞对照组（只含T淋巴细胞）、靶细胞对照组（只含靶细胞），两组对照组细胞加入量与实验组相同。

　　淋巴细胞杀伤活性=（效应细胞对照组A值+靶细胞对照组A值-实验组A值）/靶细胞对照组A值×100%〔8，9〕。

　　1.8 统计学分析

　　采用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析，所获数据用x±s表示，组间比较采用配对t检验。

　　2 结 果

　　2.1 DCs的形态学变化

　　用培养板和培养瓶培养的单个核细胞在刚贴壁的当天树突并不明显，多呈圆形（见图1A、图1B）。培养板中细胞经细胞因子诱导刺激后，于接种后第1天可见细胞有变长现象，并且有些细胞已开始出现树突；第5天可见细胞在一定程度上形成突起，形态不规则，同时有几个细胞聚集成团的现象；第7天细胞树突明显，已具有典型DCs形态，可见多细胞聚集成团的现象，且具有呈集落样生长趋势（见图1C）。在整个生长过程中，板中细胞细胞均呈贴壁生长，未见悬浮生长细胞。培养瓶中细胞，于接种第1天便开始有细胞悬起，第7天细胞基本处于悬浮状态，但分化程度不如板中DCs典型，细胞聚团生长现象不明显（见图1D）。

　　2.2 DCs对T淋巴细胞的促增殖作用结果

　　T淋巴细胞经台酚蓝染色后，细胞活力＞95%。实验组与对照组各设4个复孔，490 nm下酶标检测仪测定结果见表1。表1 不同生长状态DCs对T淋巴细胞的促增殖作用结果（略）

　　2.3 体外诱导特异性CTL免疫反应结果

　　每组均设4个复孔，490 nm酶标检测仪测定各组吸光度A值，结果见表2。表2 不同生长状态DCs的混合淋巴细胞反应结果（略）

　　3 讨论

　　在本实验DCs培养过程中，用培养板培养的细胞始终处于贴壁生长状态，特别是经胰酶消化脱壁，培养1 d后又重新稳定贴壁，这进一步证明了所培养的细胞属贴壁生长类型，并非半贴壁或悬浮生长，与一些文献中描述不相符〔3～6〕。而用培养瓶培养的DCs先贴壁生长，后悬浮生长，与有关文献报道相符。

　　从形态学角度分析，用培养板培养的DCs分化状态优于用培养瓶培养的DCs，这一点可能由于细胞贴壁生长使细小树突变得明显，也可能由于贴壁生长状态本身利于DCs分化，但准确机制与原因尚不明确；另外，由于用培养板培养细胞更易贴壁，从单个核细胞以差速贴壁法分离单核细胞时会有更高的得率。但是，从功能学角度分析，在体外促进淋巴细胞增殖及体外诱导免疫反应方面，培养瓶中培养的DCs免疫学功能优于培养板中DCs。

　　本实验认为成熟DCs的生长状态应与实验室具体培养条件相关，特别是会受到培养介质的影响。成熟DCs并非总呈半贴壁或悬浮生长，也有贴壁生长的可能性，但其免疫学功能可能会因生长状态的改变而发生变化。然而，本实验只是对DCs的生长状态与其免疫学功能关系的初步探索，所检测的免疫学功能范围也较为局限，DCs的生长状态对其自身的其他免疫学特性的影响尚不明确，其相关机制仍需进一步探索与研究。

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