8溴环磷酸腺苷对单核细胞株THP1中ABCA1及细胞间黏附分子的影响

　　　　　　作者：李建华 杨永红 贾军宏 吴平生 郭志刚

【摘要】 　　目的 观察8BrcAMP刺激下，单核细胞株THP1中ABCA1、细胞间黏附分子1（ICAM1）及 白介素1β（IL1β）mRNA和蛋白质表达的变化，阐明ABCA1基因在动脉粥样硬化（AS）形成中的可能机制。方法 复苏培养THP1单核细胞，加入8BrcAMP(0.5 mmol/L)刺激3、6、12、24 h，设未加刺激同时孵育24 h的细胞为阴性对照组；以荧光定量RTPCR和Western印迹法及ELISA法检测ABCA1、ICAM1及IL1β mRNA和蛋白质表达量；用ABCA1的反义寡核苷酸（100 nmol/L）转染THP1细胞，给予8BrcAMP刺激，同样的方法观察上述指标的改变。结果 予8BrcAMP刺激后，THP1细胞中ABCA1、ICAM1 mRNA和蛋白质及IL1β蛋白质表达均增高，给予反义寡核苷酸转染后氧化低密度脂蛋白（OxLDL）刺激3、6 h上述指标的mRNA表达降低 (P<0.01)，12、24 h蛋白质表达降低 (P<0.01)。结论 THP1单核细胞中，8BrcAMP激活ABCA1不仅可增加细胞内胆固醇外运，还具有增加炎症因子表达的作用，在AS的发生中发挥双重作用。

【关键词】 THP1单核细胞；ABCA1； 动脉粥样硬化；炎症因子

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of 8BrcAMP on ABCA1，ICAM1，IL1βin human monocytes THP1 after the treatment with 8BrcAMP.Methods 8BrcAMP (0.5 mmol/L) were added into culture media and THP1 cells were harvested at 3，6，12 and 24 hours.The mRNA and protein levels of ABCA1、ICAM1 and IL1βwere investigated by realtime fluorescent quantitative PCR，Western blot and ELISA methods.After phosphorothioate antisense oligonucleotides of ABCA1 mixture were add to culture media at a final concentration of 100 nmol/L.Results The mRNA and protein of ABCA1，ICAM1 and IL1βamount were increased after the incubated with 8BrcAMP.After transfection with antisense oligonucleotides of ABCA1，the expression of mRNA levels were decreased at 3 and 6 hours，and protein were decreased at 12 and 24 hours.Conclusions ABCA1 can contribute to atherosclerogenesis by increasing the expression of ICAM1 induced by 8BrcAMP in THP1 cells.

　　【Key words】ATPBinding Cassette A1 (ABCA1)；THP1 cell；Atherosclerosis；ICAM1

　　动脉粥样硬化(AS)过程是一个血管受损后的炎症反应过程，高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)水平与AS的发病率呈负相关。HDLC主要通过参与体内胆固醇逆转运（RCT）行使其抗AS功能。ATP结合盒转运蛋白1（ABCA1)的细胞膜蛋白介导了过剩的细胞内胆固醇外运分泌入高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）的代谢途径〔1〕。随着对ABCA1研究的深入，发现ABCA1不仅仅影响血脂，还与AS及泡沫细胞形成有明显的关联〔2〕，本研究以单核细胞株（THP1）为靶点，观察在ABCA1诱导因素8溴环磷酸腺苷（8BrcAMP）的作用下， ABCA1对细胞间黏附分子1（ICAM1）及白介素1β（IL1β）mRNA、蛋白质表达的影响，以阐明ABCA1基因在AS形成中新的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　THP1细胞株、培养基RPMI1640、胎牛血清（购自Gibco公司）、牛血清白蛋白（BSA）及8BrcAMP购自Sigma公司，细胞裂解液（Cell Signaling Technology公司）、抗ABCA1多克隆羊抗人抗体、抗ICAM1多克隆兔抗人抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠抗体（Santa Cruz Biotechnology公司）预染蛋白Marker (NEB 公司) ECL Western杂交显影试剂盒（Amersham公司），RNA逆转录试剂盒（Promega公司），荧光定量PCR反应体系（MJ公司），引物合成（北京奥科生物技术公司），ELISA试剂盒购自博士德公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 分组

　　实验分为氧化低密度脂蛋白（oxLDL）实验组和反义寡核苷酸组。oxLDL实验组指oxLDL刺激3、6、12及24 h，直接测定细胞ABCA1、ICAM1、IL1β的mRNA及蛋白质水平。反义寡核苷酸组加入硫代修饰的反义寡核苷酸培养5 h后，再加入oxLDL刺激3、6、12及24 h，测定ABCA1、ICAM1、IL1β的mRNA及蛋白质水平。

　　1.2.2 THP1细胞的培养及处理

　　复苏细胞株THP1，实验所用细胞为复苏后3～4代生长良好的人单核细胞株THP1细胞株，每次实验前以无血清的RPMI1640饥饿培养12 h，在无血清培养基中加入BSA 2 mg/ml，作为血清替代物，加入8BrcAMP (0.5 mmol/L)刺激3、6、12、24 h，设未加刺激同时孵育24 h的细胞为阴性对照组。

　　1.2.3 ABCA1、ICAM1基因表达的检测

　　提取RNA后进行逆转录反应，用荧光定量PCR反应体系试剂盒进行PCR，内参照采用βactin。逆转录反应条件42℃，60 min，95℃，5 min，4℃，5 min。PCR 反应条件：95℃，5 min，96℃，20 s，56℃，20 s，72℃，20 s，79℃，1 s，50个循环，72℃ 5 min。引物序列：ABCA1（201 bp）正义链5′ GAT GGC AAT CAT GGT CAA TGG 3′，反义链5′ AGC TGG TAT TGT AGC ATG TTC CG 3′；ICAM1（185 bp）正义链5′ CGA GGT GAC CGT GAA TGT GCT 3′，反义链5′ TGG CTT GTG TGT TCG GTT TCA 3′。

　　1.2.4 Western 蛋白印迹分析法

　　取各组样本总蛋白50 μg进行变性，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，ABCA1、ICAM1分别采用6%、7.5%凝胶，然后电转移于NC膜上，封闭NC膜过夜，漂洗后在4℃与抗ABCA1、ICAM1一抗结合4 h，再与各自的二抗4℃结合2 h，最后采用ECL试剂盒显影。

　　1.2.5 ELISA法检测细胞和培养基的ICAM1、IL1β的表达

　　细胞培养同上，收集细胞，用细胞蛋白萃取液提取各试验组的蛋白，测蛋白浓度，依照试剂盒的操作步骤进行各组的检测。

　　1.2.6 ABCA1反义寡核苷酸对ABCA1，ICAM1 mRNA和蛋白质表达的作用

　　细胞培养同上，将所用的细胞用PBS清洗，加入RPMI 1640培养基1.8 ml及脂质体和反义寡核苷酸的混合物0.2 ml（反义寡核苷酸终浓度100 nmol/L），孵箱内培养5 h后，用PBS清洗细胞，加入完全培养基继续培养18 h，然后按照步骤加入8BrcAMP进行mRNA及蛋白质表达实验。ABCA1反义寡核苷酸的序列为：5＇CATGTTGTTCATAGGGTGGGTAGCTC3＇，全程硫代修饰。

　　1.3 统计学方法

　　实验数据均来自3次重复实验并复孔测定6次，以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。多组间比较采用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 8BrcAMP对THP1细胞中ABCA1、ICAM1 mRNA的影响

　　OxLDL刺激3 h后即出现mRNA表达的增高，3、6、12、24 h ABCA1 mRNA比对照组分别增加11％、34％、21％、12％；ICAM1 mRNA 分别增加12%、55%、35%、28%；高峰时间均为6 h。给予反义寡核苷酸刺激后，3、6 h ABCA1 mRNA较对照组分别降低18％、5％； 3、6 h ICAM1 mRNA分别降低22%、5%。以上各实验点ABCA1、ICAM1与对照点比较差异均有极显著性(P<0.01)；相对应的3，6，12 h时间点，反义寡核苷酸组与oxLDL实验组比较差异均有极显著性（P<0.01），见图1。

　　2.2 8BrcAMP对THP1单核细胞中ABCA1、ICAM1蛋白质的影响

　　ABCA1在刺激3、6、12、24 h后与对照组比较蛋白表达增高15%、24%、42.9%、38.4%， ICAM1在刺激3、6、12、24 h后，蛋白质增加37.4%、75.6%、82.9%、63.4%，高峰期为12 h；给予反义寡核苷酸刺激后，12、24 h ABCA1 蛋白质较对照组分别降低14％、30％； ICAM1降低12%、24%。以上各实验点ABCA1、ICAM1与对照点比较差异均有显著性(P<0.01)；相对应的6，12，24 h时间点，反义寡核苷酸组与8BrcAMP实验组比较差异均有显著性（P<0.01）。

　　2.3 8BrcAMP对THP1细胞ICAM1、IL1β的影响

　　8BrcAMP刺激3 h后即出现各指标增高，3、6、12、24 h ICAM1比对照点分别增加13.2%、28.5%、46.1%、38.2%； IL1β分别增加54.1%、62.6%、92.4%、30.2%。给予反义寡核苷酸刺激后，ICAM1 12、24 h较对照组降低42.9%、2.2%，IL1β降低16.4%、50.1%。以上各实验点与对照点比较差异均有显著性(P<0.01)。相对应的6、12、24 h时间点，反义寡核苷酸组与oxLDL实验组比较有显著性差异（P<0.01），见表1。表1 8BrcAMP对THP1细胞ICAM1、IL1β蛋白表达的影响(略)

　　3 讨 论

　　AS是由单核淋巴细胞黏附并激活内皮细胞(EC) 而开启的一种慢性炎症性疾病〔3〕。动脉粥样斑块的形成过程是低密度脂蛋白在血管内皮下聚集，而后白细胞渗出、泡沫细胞形成、血管平滑肌细胞增殖以及大量结缔组织形成的病理过程。
　　ICAM1是参与AS的一个重要因子，在AS中血管的内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞上均出现大量而持久的ICAM1的表达，在人AS斑块处也有ICAM1的大量表达。Oishi〔4〕等认为，血清ICAM1的增高与冠状动脉硬化的进展有关，可作为冠状动脉严重性的标志，Blankenberg〔5〕等研究了1 246名经冠状动脉造影确诊的冠心病人，发现将来由于心血管病死亡的病人其血清ICAM1都明显增高。IL1β可以激活磷酸卵磷脂特异性的磷脂酶C（PCPLC），导致ICAM1的启动子如磷酸激酶C（PKC），蛋白酪氨酸激酶、NIK、IKK2、和NFκB的激活，而增加ICAM1的表达。

　　ABCA1是载脂蛋白介导的脂质转运通路中的限速蛋白质〔6〕。从整体作用认为，ABCA1具有AS保护作用。但研究发现ABCA1在AS的发生中发挥作用，Wilcox〔7〕研究证实ABCA1不仅介导细胞内胆固醇外流，而且还与AS及泡沫细胞形成有明显的关联，动脉硬化区域ABCA1基因表达明显上调。Panousis〔8〕则进一步证明巨噬细胞来源的泡沫细胞中，ABCA1 mRNA是正常巨噬细胞的3倍。ABCA1可引起LDL的氧化。Reddy〔9〕等发现ABCA1同时参与胆固醇的逆转运和LDL的氧化，因此ABCA1可能具有抗AS和致AS双重作用。

　　ABCA1属cAMP诱导的载脂蛋白受体基因，Oram〔6〕等证实cAMP可平行增加其mRNA、蛋白质表达及胆固醇外流率，增加胆固醇逆转运。Zhou〔10〕等的文章则表明cAMP可通过引起巨噬细胞中ABCA1表达增加，导致细胞内IL1β表达上升。8BrcAMP为ABCA1公认的诱导因素。本实验结果提示：8BrcAMP可以通过ABCA1的表达上调IL1β，引起炎性细胞因子MCP1的表达增加，促进AS，这可能是不同于以往的8BrcAMP增加细胞内胆固醇外流的新途径。

　　总之，在整体水平，ABCA1具有增加HDLC及逆胆固醇转运作用，从而抗AS，但在细胞水平，ABCA1还具有增加炎症因子表达的作用，其深入的调控机制值得进一步研究。

参考文献

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