一种新型的有关围绝经期综合征细胞模型的建立及分析

　　　　　　 作者：卢金福 洪敏 杜萍 朱荃

【摘要】 目的 建立围绝经期综合征的细胞模型。方法 在成年鼠卵巢颗粒细胞中加入终浓度为30%、20%、10%的灭活与非灭活的围绝经期、成年期、幼年期大鼠血清，用MTT法测定颗粒细胞生长情况。结果 在非灭活的血清中，各终浓度的围绝经期大鼠血清对颗粒细胞均有显著的促进作用，而成年期、幼年期大鼠血清中，只有10%组对颗粒细胞有显著的促进作用。所有灭活的鼠血清对颗粒细胞的生长均有良好的支持促进作用，其中终浓度为10%的围绝经期大鼠血清对颗粒细胞生长的支持作用最小。结论 10%灭活的围绝经期大鼠血清与成年鼠颗粒细胞的共培养系统可用于围绝经期综合征药物高通量筛选的平台。

【关键词】 围绝经期综合征；细胞模型；颗粒细胞

围绝经期是指妇女卵巢功能逐渐衰退至完全消失的一个过渡时期，由于体内雌激素水平长期处于低下状态，从而引发各种临床症状。围绝经期综合征的病变实质是卵巢分泌功能的衰退，因此目前该病理模型的复制主要是采用手术、药物等手段造成卵巢功能的衰减或丧失，如去势型、去势加中药型、X线损伤型、乙醇型等〔1～6〕。这些模型在不同的侧面反应临床更年期综合征的一些特点，但尚未有围绝经期综合征的细胞模型报道。本文通过不同浓度、不同生长期的大鼠血清，与成年大鼠卵巢颗粒细胞共同培养，观察不同生长期大鼠血清对成年鼠卵巢颗粒细胞生长的影响，从而寻找理想的围绝经期治疗药物在细胞水平高通量筛选的实验方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 药品与试剂 DMEM/F12培养基，美国GIBCO公司。Dhank′s液（自制）。小牛血清（FCS），杭州四季清血清厂。噻唑蓝（MTT），Ultra pure grade，Amresco分装，Easy Biotech怡成生物。二甲亚砜（DMSO），AR，上海久意化学试剂有限公司。台盼蓝：Chroma进口分装，上海化学试剂厂。

　　1.1.2 实验动物 SD大鼠，雌性，220～280 g，上海斯莱克实验动物责任有限公司，许可证号SCXK(沪)20030003。

　　1.1.3 实验仪器 Spectra MAX 190：美国Molecular Devices公司。APCO CO2 INCUBATOR：Precision Scientific。倒置生物显微镜：XSZD2，重庆光学仪器厂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 非灭活围绝经期、成年期、幼年期大鼠血清对成年期大鼠卵巢颗粒细胞生长的影响 取7只雌性SD大鼠，脱颈处死，放入盛有75%酒精的玻璃缸内，浸泡2 min。在无菌条件下取出卵巢，用Dhank′s冲洗卵巢，随后剪去多余的脂肪等附着组织，在体视显微镜下用注射针头刺破卵泡，轻轻挤压，400目钢筛过滤，离心（900 r/min，5 min），计数；用0.4%的台盼蓝检查细胞活率。最后以106个/ml种板，每个浓度6复孔，第4天更换新的、预温的培养基，并加入鼠血清，形成3个不同的终浓度：30%、20%、10％，继续培养，另设正常培养组（大鼠血清终浓度为0）以作对照。第6天用MTT法测定细胞生长情况。

　　1.2.2 灭活围绝经期、成年期、幼年期大鼠血清对成年期大鼠卵巢颗粒细胞生长的影响 将大鼠血清在56℃，30 min灭活、取材、细胞培养及检测、灭活鼠血清的终浓度同上。

　　1.2.3 不同雌二醇浓度对体外培养的卵巢颗粒细胞生长的影响 在正常培养后的第4天，将不同浓度的雌二醇（E2）加入到颗粒细胞的培养系统中，形成以下不同的终浓度：0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、10、100、1 000 ng/ml，6复孔，第4天更换培养基，继续培养，第6天用MTT法测定细胞生长情况。

　　1.3 统计学处理 数据以x±s表示，组间比较用t检验。

　　2 结果

　　2.1 非灭活围绝经期、成年期、幼年期大鼠血清对成年期大鼠卵巢颗粒细胞生长的影响 与正常培养的颗粒细胞相比(0.186±0.016)，围绝经期大鼠血清三个终浓度组的卵巢颗粒细胞生长均显著提高（P＜0.05，P＜0.01）；而成年鼠及幼年鼠仅血清终浓度为10％组的颗粒细胞生长有显著提高（P＜0.01）。相同的血清终浓度比较时，终浓度为10％的围绝经期大鼠血清组颗粒细胞生长显著高于成年鼠及幼年鼠血清组颗粒细胞的生长（P＜0.05，P＜0.01），见表1。与正常培养的颗粒细胞相比，所有灭活的血清对卵巢颗粒细胞生长均有显著促进作用（P＜0.01）。将相同终浓度的灭活大鼠血清组间比较，发现10％围绝经期大鼠血清终浓度组的颗粒细胞生长显著低于相应的成年鼠组（P＜0.01）；而围绝经期大鼠血清3个终浓度组的颗粒细胞生长显著低于相应的幼年鼠组（P＜0.05，P＜0.01），结果见表1。相同年龄期的灭活与非灭活大鼠血清同浓度间的比较：灭活血清的各组颗粒细胞生长显著高于非灭活血清组（P＜0.05，P＜0.01），结果见表1。

　　表1 灭活与非灭活的大鼠血清对正常大鼠卵巢颗粒细胞生长的影响（略）

　　与正常培养的颗粒细胞组比较：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与相同终浓度非灭活围绝经期组比较：3）P＜0.05，4）P＜0.01；与相同终浓度灭活围绝经期组比较：5）P＜0.05，6）P＜0.01；与相同年龄期的非灭活大鼠血清同浓度比较：7）P＜0.05，8）P＜0.01

　　2.2 不同E2浓度对体外培养的卵巢颗粒细胞生长的影响 将不同浓度的E2加入到颗粒细胞的培养系统中，形成8个不同的终浓度：0.1、0.2、0.4、0.8、1、10、100、1 000 ng/ml。结果发现上述E2的8个终浓度组的颗粒细胞的生长与E2终浓度为0组相比，无显著性差异。

　　3 讨论
　　
　　对于大鼠的颗粒细胞而言，大鼠血清的同源性显然要优于小牛血清，因此鼠血清比小牛血清更有利于大鼠颗粒细胞的生长。因此，直接将非灭活的大鼠血清加到颗粒细胞的培养系统中，观察其对颗粒细胞生长的影响，本结果显示，非灭活的围绝经期大鼠的血清比非灭活的成年鼠、幼年鼠的血清更有利于颗粒细胞的生长。
　　
　　补体是存在于人或脊椎动物血清与组织液中的一组具有酶活性的蛋白质，补体激活后参与抗体的免疫反应，有溶解细菌及细胞的作用。血清的灭活主要的目的是为了破坏补体，为消除补体的影响，用灭活的大鼠血清进行上述同样的实验，本结果提示，尽管大鼠血清与大鼠的颗粒细胞同源性较好，但血清中的补体等活性成分对颗粒细胞生长的影响明显〔7，8〕。Kumru等人〔9〕认为，雌激素与机体的免疫功能之间的关系复杂，但雌激素的显著缺乏有损于机体的免疫系统。因此笔者认为，同样是非灭活的血清，围绝经期大鼠血清对颗粒细胞的免疫损伤较小，该推测与本实验结果基本相符。
　　
　　围绝经期是进入老年期的过渡时期，各方面机能逐渐衰退或者紊乱，如内分泌、心血管、免疫系统等〔9〕，血清中维持组织细胞正常功能的激素等活性物质逐渐下降，而与衰老相伴而来的有害的活性物质会逐渐增多，如破损蛋白、氧化应激相关的自由基、TNFα、AGEs等〔10～13〕。由此推测，3种灭活大鼠血清对颗粒细胞生长的支持作用大小顺序应该是：最大的是幼年期大鼠血清，最小的是围绝经期大鼠血清，成年期大鼠血清介于上述两者之间。本实验的结果与上述分析基本一致。幼年鼠处于生长的旺盛期，体内富含多种生长因子，因此，灭活后的幼年鼠血清对颗粒细胞的生长作用支持最好可能与此有关。
　　
　　从不同终浓度的E2加入到颗粒细胞中的结果显示，E2对体外培养的颗粒细胞的生长无明显影响，由此推论，3个年龄期的大鼠血清中可能存在的不同水平的E2对培养的颗粒细胞无明显影响，因此灭活的围绝经期大鼠对颗粒细胞生长的支持作用下降并非由于E2水平的低下所致，很可能是E2以外的因素，对于这些未知的因素有待于我们今后深入研究。
　　
　　上述实验结果为我们提供了一个较为可行的细胞水平的围绝经期药物的高通量的筛选平台，即：10%围绝经期大鼠灭活血清与成年鼠颗粒细胞的共培养系统。

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