作者：赵旭 代平 金钊 杨仁旭
【摘要】 目的探讨左归丸对糖皮质激素性骨质疏松大鼠骨生物力学及骨密度的改善作用及其机制。方法将66只SD大鼠随机分为6组，每组11只，正常对照组大鼠予等量生理盐水肌注，其余大鼠予地塞米松1 mg/kg肌肉注射，每周2 次，连续8周。阳性对照组在肌注地塞米松的同时灌服盖中盖复方碳酸钙混悬溶液，左归丸低、中、高剂量组予相应中药灌胃，模型组及正常对照组大鼠予等体积生理盐水灌胃，1次/d，共8周。给药8周后股静脉取活血杀动物，离心取血清做生化指标检测;取大鼠股骨，测量股骨骨矿含量、骨密度并取腰椎进行骨生物力学测定。结果模型组血清碱性磷酸酶上升，腰椎骨生物力学性能下降，股骨骨矿含量、骨密度下降。中药左归丸高、中剂量组及碳酸钙组能使实验大鼠骨矿含量、骨密度增加，尤以中剂量组明显;左归丸高、中剂量组能改善腰椎骨生物力学性能，中剂量组效果较明显。以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论中药左归丸对糖皮质激素性大鼠骨质疏松骨生物力学有改善作用，能使实验大鼠骨矿含量、骨密度增加。其疗效可能与方中药物具有调整骨代谢，增强骨细胞活性，减少骨吸收，增加骨形成作用有关，表明中药左归丸对骨质疏松确有治疗作用。
【关键词】 糖皮质激素性骨质疏松; 骨密度; 骨生物力学; 左归丸
糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid induced osteoporosis，GIO)是糖皮质激素(glucocorticoid，GC)通过促进破骨细胞介导的骨吸收及抑制成骨细胞介导的骨形成而引起骨质疏松。近年来随着疾病谱的变化和一些新疾病的出现，该病发病率剧增，已经成为仅次于绝经后和老年性骨质疏松症的第三位骨质疏松症原因，且发病率呈逐年增加的趋势。目前西医防治主要应用钙制剂、Vit D、二磷酸盐、降钙素、甲状旁腺素等，虽有一定疗效，但存在价格昂贵、吸收差、副作用多的情况。祖国医学认为“肾为先天之本”，“肾主骨生髓”。《素问·生气通天论》言：“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也，其充在骨。”即骨的生长、发育、强劲、衰弱与肾精盛衰关系密切，肾精充足则骨髓生化有源，骨骼得以滋养而强健有力;反之肾精亏虚则骨髓生化无源，骨骼失养而痿弱无力，易致本病的发生。言及GIO，我们认为糖皮质激素为外源性“纯阳”之品， 超剂量应用可使肾阴精亏虚，骨失濡养，而致骨质疏松。左归丸出自《景岳全书》，具有滋阴补肾，填精益髓之功，是治疗真阴不足的经典方剂，临床应用广泛。实验研究方面，目前用左归丸原方进行的研究为数寥寥，国内医者多对其加减化裁之后“流”方进行探索，却忽视了对左归丸这一“本”方的研究，从而一定程度上制约了该类方药作用机制的深入发展。本研究组前期实验已证实左归丸对绝经后骨质疏松症具有良好治疗效果[1，2]，今以糖皮质激素性骨质疏松症为模型，观察该方对GIO的疗效并初步探讨其作用机理，以期进一步丰富其防治骨质疏松症的理论和实验基础。
1 材料
1.1 药物 左归丸浸膏(熟地、山茱萸、枸杞子、菟丝子、川牛膝等药物组成)，由成都中医药大学制剂室提供，每毫升含生药1 g，使用时加蒸馏水配制成一定浓度的溶液灌胃;阳性对照组盖中盖由哈药集团制药六厂生产，每片含钙500 mg 维生素D 100IU，批号20070110-2，使用时加蒸馏水配制成混悬液灌胃;地塞米松磷酸钠注射液，西南药业股份有限公司生产，规格5 mg/支，批号:0703000 。碱性磷酸酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所第一分所，批号：0408。
1.2 动物 SD大鼠66只，雄性，6月龄，体质量220～260 g ，购自四川省医学科学院实验动物研究所[合格证号scxk(川)2004-16]。全价颗粒饲料喂养，自由摄食、饮水，室温调节在(24±2)℃，空气流通。
1.3 仪器及试剂 半自动生化分析仪由法国SECOMAM公司生产，型号BASIC 70V-BO370。岛津电子万能试验机，型号AG-IS。双能X线骨密度测定仪DPX公司生产，GE-LVNAR。
2 方法
2.1 分组成都中医药大学时间生物实验室系四川省重点实验室，实验全程在该实验室进行。动物称重后随机分为6组，即正常对照组(简称正常组)、模型对照组(简称模型组)、碳酸钙对照组(简称碳酸钙组)及左归丸高、中、低剂量组，每组11只。适应性喂养1周后，正常组大鼠予等量生理盐水肌注，其余大鼠予地塞米松1 mg/kg肌肉注射，每周2次，连续8周。正常组及模型组生理盐水灌胃，阳性对照组同时灌服复方碳酸钙混悬溶液(用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液配制，其有助悬作用)，给药剂量为1.25 g/kg，左归丸高、中、低剂量组按10，5，2.5 g/kg·d的剂量灌胃给药，1次/d，共8周。实验过程中每周称重1次，根据体重调整给药量。实验全程所有动物在同等条件下饲养， 自由饮水和摄食。8周后，股静脉取血活杀动物，离心取血作生化、放免指标检测，取左侧股骨裹入浸透生理盐水的湿纱布，置于-20℃条件保存，行骨密度检测，腰椎用同样方法保存，做生物力学测定。
2.2 观察指标 取大鼠左侧股骨、腰椎骨(L1)，检测左侧股骨骨矿含量﹑骨密度，进行腰椎压缩试验，测定L1骨生物力学参数-最大载荷属和破坏应力。最大载荷是结构力学参数，指试件受力点所能承受的最大外力，而破坏应力属材料力学参数，是指最大载荷作用下试件受力截面单位面积上的内力。
2.3 统计方法 所得数据以±s表示，采用SPSS11.5统计软件进行数据处理。多样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有显著的统计学意义。
3 实验结果
3.1 左归丸对各组大鼠L1椎体最大载荷及破坏应力的影响 见表1。表1 各组大鼠L1椎体最大载荷及破坏应力变化情况与模型组比较，*P<0.05
3.2 左归丸对股骨骨矿含量﹑骨密度的影响 见表2。表2 各组大鼠股骨骨矿含量(BMC)﹑骨密度(BMD)的变化情况与模型组比较，*P<0.05;与碳酸钙组比较，#P<0.05;n=6
3.3 血清碱性磷酸酶的变化情况 见表3。表3 各组大鼠碱性磷酸酶(ALP)的变化情况(±s)
组别ALP/IU·L-1空白 146.26±39.23模型 266.79±25.85碳酸钙 142.05±37.85*左归丸(高) 159.80±44.07*左归丸(中) 159.69±42.94*左归丸(低) 126.88±40.80*
与模型组比较，*P<0.05;n=6
4 讨论
骨生物力学是研究骨组织在外界作用下力学特征和骨在受力后的生物学效应，是对骨质量进行评定的一种可靠方法。大量的动物实验和临床研究结果表明单纯骨矿含量的增加，骨质量并不一定相应增加，有时反而降低，因此对骨生物力学进行研究，不但有助于对骨质量进行直接评价，而且也是评价各种对抗骨丢失措施的最佳方法之一。故本实验即以大鼠腰椎的骨生物力学为观察要点之一，通过腰椎压缩实验得到最大载荷和破坏应力两个指标，研究实验动物的骨质量。最大载荷直接反映松质骨的骨小梁的骨质、结构的连续性，皮质骨的强度，骨的横截面的大小等，是对骨质量的综合反映。破坏应力骨试件所能承受的最大应力即体现骨的压缩强度。从表1可知，与正常组比较，模型组腰椎的最大载荷、破坏应力均有明显下降(P<0.05)，显示造模成功。与模型组比较，碳酸钙组，左归丸高、中剂量组的上述生物力学参数明显增强(P<0.05)，与碳酸钙组比较，从下面图1～2可以看出最大载荷和破坏应力左归丸高、中剂量组的增长趋势较碳酸钙组明显，尤其是中剂量组。说明应用碳酸钙，左归丸高、中剂量进行干预，可提高腰椎的力学强度，使腰椎的生物力学性能得到明显改善和恢复，中药组疗效略优于西药组，尤以中剂量组为佳。
骨密度是指骨骼单位面积中矿物质的含量，骨矿物含量减少即骨密度下降是骨质疏松的主要病理表现，因此是目前用于骨质疏松诊断、骨折危险度评价中必不可少的指标。近年较多文献报道了体重指数(BMI)对骨密度的影响，认为其与骨密度呈正相关[3，4]。不考虑BMI的影响而单纯考量骨密度，往往会得出不合理的研究结果。因此本实验在作骨矿含量﹑骨密度分析时，把体重作为一个权重加在分析中，并得到了有规律的结论。结果显示：与正常组相比，模型组骨矿含量﹑骨密度有明显下降 (P<0.05)，显示造模成功。与模型组相比，碳酸钙组，左归丸高、中剂量组的骨矿含量﹑骨密度明显增强(P<0.05);与碳酸钙组比较，左归丸中剂量组骨密度与其有显著差异(P<0.05)。说明左归丸可以显著改善糖皮质激素对大鼠骨密度的影响，以中剂量组最明显。
血清碱性磷酸酶是最常用的评价骨形成和骨转换的的一个重要的生化指标，临床上将其作为骨质疏松诊断的参考指标。血清中碱性磷酸酶有50%来源于骨，碱性磷酸酶的活性可反应成骨细胞特别是新形成的成骨细胞的活性及状态。钙的缺乏可引起继发性的甲状旁腺的功能亢进，使骨吸收增加，导致骨代谢的紊乱。从表3可知，与正常组相比，模型组血清中的碱性磷酸酶量明显升高，有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，碳酸钙组，左归丸高﹑中﹑低剂量组血清中的碱性磷酸酶量有所降低，有统计学意义 (P<0.05)，这说明应用左归丸高、中、低剂量进行干预，可降低血清中碱性磷酸酶的量，而这可能是该方治疗GIO的上游机制之一。
综上所述，经典古方左归丸能明显改善糖皮质激素性骨质疏松症的骨生物力学和骨密度，同时纠正血清中碱性磷酸酶量的异常，可能与其纠正异常骨代谢，抑制骨吸收，促进骨形成有关。中剂量左归丸对大鼠骨生物力学和骨密度的作用优于低、高剂量组，这可能是因为药物浓度过低效用未能完全发挥，而浓度过高，不易被胃肠道吸收，也会影响疗效。
参考文献
[1] 郑云霞，杨仁旭，陈 红. 滋肾丸对去卵巢骨质疏松雌鼠的骨组织形态学的改善作用及机制的实验研究[J].四川中医，2006，24(2):16.
[2] 陈 红，杨仁旭，郑云霞.滋肾丸抗去势雌鼠骨质疏松症的实验研究[J].川北医学院院报，2007，22(1)：20.
[3] 李 兰，周 倜，邵晋康.体重质量指数与557例绝经后妇女骨密度变化的关系研究[J].中国骨质疏松杂志，2004，10(4)：493.
[4] Wang MC，Bachrach LK.Van Loan M ，et a1 .The relative contributions of lean tissue mass an d fat mass to bone density in young women[J].Bone，2005，37(4)：474.