【摘 要】 指数式扩增配体的系统进化 (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment SELEX) 技术是一类新的体外组合化学筛选技术，通过它能获得高效地与多靶物质特异性结合的单链或双链寡核苷酸适配子(aptamer)，目前已广泛应用于肿瘤的诊断与治疗中。SELEX 技术获得的适配子与蛋白质类抗体相比具有多种优势，展现出了在肿瘤诊断和治疗方面的极大潜能。本文主要就SELEX 技术在肿瘤诊断和治疗两方面的应用进展作一综述。
【关键词】 SELEX 技术；核酸适配子；肿瘤诊断；肿瘤治疗
指数式扩增配体的系统进化技术(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)是一项由Ellingtong 和Tuerk[1，2]在20 世纪90 年代初建立的体外组合化学筛选技术，由其获得的核酸适配子(aptamer)，是一段具有明确三级构象的短的单链或双链寡核苷酸序列， 即DNA(ssDNA、dsDNA)或RNA。核酸适配子的出现，改变了人们对核酸只能做遗传物质的传统认识，利用核酸结构的多样性，可使核酸适配子高效、特异地结合各种与之空间构象互补的靶分子。利用SELEX 技术筛选获得适配子识别靶分子的模式与抗体类似，但与蛋白质类抗体相比，核酸类适配子具有更多的优越性，如结合力强、亲和力高、特异性好、库容量大、靶分子范围广等[3]。这些特性使得核酸适配子在疾病的诊断与治疗领域成为更为有效的工具。
1 SELEX 技术的基本原理
SELEX 过程包括以下几个步骤[4]：①构建文库：在体外人工构建一个含有1012～1015 个随机寡核苷列文库，随机寡核苷酸片段的长度一般为20～40bp；②筛选、分离：在适宜条件下，使随机单链寡核苷酸序列与靶分子相互作用，分离出与靶分子特异结合的寡核苷酸序列；③扩增：PCR 扩增特异结合的寡核苷酸适配子，用作新一轮筛选。以上三步构成一轮完整的SELEX 过程。重复筛选、分离、扩增的循环步骤5～15 轮，特异性适配子不断得到富集，最后得到高特异性、高亲和力的适配子。
2 SELEX 技术在肿瘤诊治中的应用
虽然抗体是目前应用于人类肿瘤诊治过程中进行分子识别的主要物质，但是核酸适配子表现出的高敏感性、低毒性、低免疫原性和小分子量等优势[5]，弥补了抗体在诊断领域中的不足，使得核酸适配子可以代替其成为理想的肿瘤诊断和治疗试剂。
2.1 SELEX 技术在肿瘤诊断中的作用
由SELEX 筛选技术得到的核酸适配子因为其便于进行化学修饰和二、三级折叠构象改变的特点，常与其他技术结合，应用于肿瘤标志物的检测。
2.1.1 体内肿瘤分子成像
肌腱蛋白-C(tenascin-C，TN-C)是肿瘤组织基质中表达的一种胞外蛋白，在肿瘤生长中过度表达。Hicke 等[6]以TN-C 高表达的U25l 神经胶质母细胞瘤细胞系为靶标，通过SELEX 技术筛选得到能够与TN-C 特异结合的核酸适体TTA1，将其用放射性同位素99mTc 标记，注射到种植了人胶质母细胞瘤和乳腺癌的裸鼠模型体内，检测Tenascin-C，通过二维闪烁成像能获得清晰的肿瘤图像。研究表明，TTA1 能被肿瘤组织快速摄取并滞留较长的时间，而在血液和其他非靶标组织中却被迅速清除，这一特点使之非常适用于肿瘤的影像诊断[7]。
2.1.2 肿瘤相关蛋白检测
随着SELEX 技术的发展，越来越多能与细胞外、细胞膜上、细胞内肿瘤相关蛋白靶向结合的具有抗肿瘤特性的核酸适配子已经应用于临床肿瘤诊断中[8]。其中与肿瘤相关膜抗原特异性结合的适配子应用更为广泛、成熟。
2.1.2.1 前列腺特异性膜抗原
前列腺特异性膜抗原（PSMA）是一种只在前列腺癌细胞表面高表达而在正常细胞表面不表达的高特异性膜结合蛋白，因此成为检测前列腺肿瘤细胞的标志物。Lupold[9]等人利用SELEX 技术筛选出两种适配子A9 和A10 来阻断纯化的胞外PSMA结构域。这是首次报道RNA 适配子能与肿瘤相关的膜抗原特异性结合。Chu[10]等把该种核酸适配子连接到发光纳米晶体上，发现这种结合物能与过表达PSMA 的固定细胞及活体细胞特异性结合，可作为前列腺癌的诊断试剂。
2.1.2.2 MUC1
MUC1 是一种在多种人类肿瘤细胞，尤其是腺癌细胞表面高表达的糖蛋白。MUC1 分布在血流中并已成为膀胱癌的肿瘤标志物。Ferreira[11]等人利用SELEX 技术筛选出一种能与之结合的DNA 适配子，而在随后的试验中，这种适配子又表现出对乳腺、直肠、肺、胰腺肿瘤细胞的特异性结合能力。Xiang[12]等利用此种适配子检测尿液上皮特异性肿瘤蛋白MUC1 水平，用于膀胱癌的诊断及预后检测。
2.1.2.3 EGF 受体
研究表明，EGF 受体（EGFR）在多种人类肿瘤中过度表达的、高度特异性的酪氨酸激酶 [13]。利用单克隆抗体检测EGFR 已经应用于临床肿瘤诊断，而利用适配子与EGFR 的靶向结合来进行肿瘤断的前景相当诱人，因为EGFR 可通过内涵体进行内在化，完成胞内传送[14]。Li[15]等应用SELEX技术成功获得了能阻断EGFR 胞外结构域的RNA核酸适配子，向肿瘤细胞内部传送纳米粒子，完成肿瘤诊断。
2.2 SELEX 技术在肿瘤治疗中的作用
核酸适配子可特异性与靶蛋白结合，封闭这些蛋白上的结合位点，阻断了这些蛋白的功能发挥，因而成为有效的蛋白活性阻断剂，从而发挥治疗作用。其治疗肿瘤的原理包括抑制新生血管生成、阻断细胞信号转导、抑制细胞增殖、抑制肿瘤转移、促进肿瘤细胞凋亡等[16]。
2.2.1 抑制肿瘤转移
NOXXON 公司最近宣布成功完成有关NOX-A12 的第一阶段临床试验[17]。NOX-A12 是一种阻断SDF-1 的核酸适配体，实验显示SDF-1 这种蛋白质可以与多种细胞趋化因子受体结合并在肿瘤生长和转移中发挥重要的作用。应用NOX-A12阻断SDF-1 从而抑制肿瘤转移将成为肿瘤治疗的一种新方法[18] 。
2.2.2 抑制肿瘤细胞增殖
核仁蛋白(nucleolin)是一种能与RNA 或单链DNA 结合的核蛋白，存在于正常细胞的细胞核内，但在癌细胞中却位于细胞表面。AS-1411 作为一种能与核仁蛋白特异性结合的核酸适配子，其内在化导致一些与癌症相关的mRNAs 的减少，从而抑制癌细胞增殖[19]，且不影响正常细胞，是一种新型的核酸适配子药物。在体外，AS-1411 可以抑制多种肿瘤细胞系的增殖；在体内，AS-1411 在乳腺癌的裸鼠模型中表现出抗肿瘤效应，且具有良好的安全性 [14]；在末期临床试验中，AS-1411 可以与多种癌细胞表面的核仁蛋白(nucleolin)结合，例如急性粒细胞白血病（AML）、宫颈癌等，对多种肿瘤细胞的增殖均有抑制作用。
2.2.3 抑制血管生成
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth actor，VEGF)是新生血管形成的最重要调节因子，能特异性地刺激内皮细胞增生，促进微血管生长，从而为肿瘤生长提供营养。
整合蛋白αβ3[20]在血管内皮细胞增殖和移行的调节中起重要作用，Mi等[21]筛选出整合蛋白αβ3 的核酸适体探针，使血管内皮细胞的增殖和存活被明显抑制，从而抑制肿瘤血管新生，抑制肿瘤细胞的增殖。
肿瘤的异常增生与肿瘤细胞内信号转导过程中的重要分子密切相关。信号转导中的关键蛋白都可以作为肿瘤治疗的靶标。Cerchia 等[22]采用以全细胞为靶标来获得核酸适配子的细胞-SELEX 技术，筛选出能识别位于细胞膜上的原癌基因ret 受体酪氨酸激酶的核酸适配子。这种适配子不仅能与ret 受体激酶的胞外结合域相结合，还阻断了ret 下游信号的传递，从而抑制肿瘤细胞生长、增殖及发育分化。
3 展望
随着SELEX 技术的发展，许多新近发现的改良SELEX 技术不断涌现。核酸适配子技术在肿瘤靶向诊治领域拥有巨大优势。在今后的10 年中，随着纳米技术和RNA 干扰技术的发展成熟，更加复杂和多功能的多价核酸适配子将在临床诊治中发挥作用。实验证明，多价适配子的特异性结合能力要远高于单价适配子，这也使其拥有更好的临床应用前景[14]。虽然前景非常乐观，但是阻碍核酸适配子应用于临床诊治中的一个重要因素是其相对较短的半衰期和较高的肾清除率[4，23]。如何增大核酸适配体的分子量，延长半衰期，加强靶向性，将是今后适配子临床各诊治领域重要的，具有挑战性的研究方向。
参考文献
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