作者：钟灿灿 沈雁 刘建伟 陈志棠 唐毅
【关键词】 肝癌细胞
摘要:目的 研究三氧化二砷(As2O3)对肝癌细胞株HepG2，BEL7402的抑制作用。方法 用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测用As2O3对肝癌细胞株HepG2，BEL7402生长及抑制率的影响；凋亡电泳检测电泳条带，流式细胞仪（FCM）分析细胞周期和凋亡率变化。结果 在0.1~50.0 μmol/L的浓度范围内As2O3对BEL7402、HepG2细胞的生长均有明显的抑制作用，且有时间和浓度的依赖性；凋亡电泳显示5 μmol/L As2O3对肝癌细胞株HepG2，BEL7402凋亡率分别是46.7%和53.1%；流式细胞仪DNA组方图上可见细胞G1前期出现亚二倍峰。 结论 As2O3可抑制肝癌细胞株HepG2，BEL7402的生长，且在一定的范围内，抑制率具有一定的浓度和时间依赖性；As2O3对BEL7402细胞株的生长抑制作用大于HepG2；As2O3抑制肝癌细胞株HepG2，BEL7402生长的作用与细胞凋亡有关。
关键词:肝癌细胞；凋亡；三氧化二砷
三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)是中药砒霜的主要成分，在治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)取得了显著的临床效果［1］，As2O3在实体瘤方面的治疗也逐渐增多［2］。As2O3治疗APL的有效浓度是10 μmol/L，而在体外抑制人肝癌细胞株HepG2的有效浓度有可能&<5 μmol/L［3］，本研究旨在观察As2O3对人肝癌细胞株HepG2和BEL7402生长的影响，以探讨As2O3对原发性肝癌的作用及其机制，为寻找有效的肝癌化疗药物提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
肝细胞株HepG2、BEL7402由中山大学细胞库提供，As2O3、四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Sigma公司，RPMI 1640培养基购自Gibco公司，小牛血清购自杭州四季清公司，二甲基亚砜（DMSO，进口分装）。二氧化碳培养箱(SHELLAB，美国)，酶标仪(Reder，日本)。
1.2 分组
本实验分为HepG2和BEL7402组：分别加入As2O3，终浓度为0(对照组)、0.1、0.5、1、5、10和50 μmol/L，以RPMI1640培养液稀释，观察不同浓度对肝癌细胞株的影响。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
在37 ℃、5%CO2培养箱，用含10%小牛血清及青霉素、链霉素各1×105 U的RPMI1640培养基培养，每2天换一次液，收集对数生长期的细胞进行实验。
1.3.2 MTT法观察As2O3对肝癌细胞株生长的影响。
取对数生长期细胞，用RPMI1640培养液调整细胞为6×104/mL，接种于96孔培养板，每孔100 μL细胞悬液，培养24 h待细胞贴壁后按实验分组加入不同浓度药物，每孔100 μL药物，对照组加入100 μL培养液，每组浓度4个重复孔，放入37 ℃、5%CO2培养箱培养72 h后，每孔加入MTT （5 mg/mL）20 μL，再培养4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 200 μL振荡溶解10 min，待甲瓒完全溶解后进行比色，在酶标仪以570 nm主波长/690 nm参比波长检测吸光度A值，并计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率，细胞生长抑制率：细胞生长抑制率＝［(1-实验组平均A值）/对照组平均A值］×100%。
1.3.3 DNA抽提及电泳
经药物处理96 h的细胞分别加裂解液和蛋白酶K，55 ℃水浴20 min、加RNA酶10 μL作用2 min，酚、氯仿异戊醇各抽提1次，无水乙醇沉淀DNA，取已抽提好的DNA5 μL，在1.5%琼脂糖凝胶，5 V/cm条件下，电泳3 h，以λDAN Marker Ⅶ为分子标志，302 nm紫外光透照，观察电泳条带。
1.3.4 流式细胞仪分析
5.0 μmol/L As2O3作用于肝癌细胞株HepG2和BEL7402处理4 d后，离心收集细胞，应用PBS液洗涤2次，加入70%乙醇固定，离心去除上清液，加入200 μL RNA酶在37 ℃处理1 h，然后加800 μL PI染色液放置4 ℃冰箱内30 min以上，应用流式细胞仪检测细胞周期分析。
1.3.5 统计学方法
用SPSS11.0进行方差齐性检验及单因素方差分析。以P&<0.05为有显著性。
2 结 果
2.1 不同浓度As2O3对BEL7402、HepG2细胞生长的抑制作用
As2O3在浓度1.0~50 μmol/L As2O3，抑制肝癌细胞株BEL7402，HepG2呈剂量的依赖性，浓度越高，细胞生长越低。结果显示：在0.1~5.0 μmol/L的浓度范围内As2O3对BEL7402、HepG2细胞的生长均有明显的抑制作用。且有时间和浓度的依赖性，浓度越大，时间越长，对细胞生长的抑制作用越大。As2O3对BEL7402细胞株的生长抑制作用大于HepG2，见图1。
2.2 DNA电泳的检测
5.0 μmol/L As2O3作用于HepG2和BEL7402细胞4 d后，细胞DNA电泳上出现明显的DNA梯状降解条带，而经1.0 μmol/L As2O3作用后的细胞Ladder带不明显，见图2。As2O3作用于BEL7402细胞有同样结果。
三氧化二砷对肝癌细胞株的体外抑制作用图1 不同浓度As2O3对BEL7402，HepG2细胞生长的抑制率
2.4 流式细胞仪检测（FCM）
5.0 μmol/L As2O3作用于肝癌细胞株HepG2和BEL7402处理4 d后，在流式细胞仪DNA组方图上可见细胞G1前期出现亚二倍峰。根据亚二倍峰的面积计算凋亡细胞在整个细胞群中的比例，这两种肝癌细胞株的凋亡率分别是46.7%和53.1%，见图3。
3 讨 论
三氧化二砷是我国传统医药砒霜的主要成分，自1979年我国首次报道砷剂治疗急性早幼粒细胞白血病并取得了显著性效果。近年来，人们将As2O3研究的重点转移到各种实体瘤的治疗上，在对实体瘤的研究中发现As2O3可以抑制肝癌细胞端粒酶的活性，抑制肝癌细胞株血管内皮生长因子的表达，从而诱导细胞凋亡［4，5］。
我们通过采用MTT法检测不同浓度As2O3对肝癌细胞株HepG2和BEL7402的细胞抑制作用的实验，结果表明As2O3可以使肝癌细胞株HepG2和BEL7402的生长受到明显的抑制作用，其抑制作用具有时间及剂量依赖性，此结果与文献［6］报道相似，进一步证实了As2O3的体外抑瘤作用。有报道低浓度为2～4 μmol/L的As2O3仅能抑制肝癌细胞的增殖而不引起凋亡［7］，但在本实验组5 μmol/L As2O3凋亡电泳出现凋亡条带，FCM显示对肝癌细胞株HepG2，BEL7402凋亡率分别是46.7%和53.1%，提示5 μmol/L的As2O3可引发肝癌细胞株出现凋亡，As2O3抑制肝癌细胞株HepG2，BEL7402生长的作用与细胞凋亡有关。有报告［8］用As2O3抑制肝癌细胞株HepG2多耐药基因，显示As2O3抑制RHepG2增殖并阻止其进入细胞周期，能抑制P糖蛋白的过分表达。本实验通过流式细胞仪的检测，细胞在G1期前出现特征性的亚二倍峰(凋亡峰)。
根据抗癌药物的敏感标准，药物的敏感性仅与凋亡发生率有关，肿瘤细胞的凋亡阈值与化疗效果有着某种内在联系［9］。As2O3可上调细胞凋亡促进基因bax和Fas表达，下调凋亡抑制基因bcl2的表达，从而达到促进细胞凋亡的目的［10］。As2O3抑制BEL7402细胞生长所需时间较SMMC7721细胞短，使用的剂量低，BEL7402和SMMC7721对As2O3存在敏感差异［11］。本实验也显示As2O3对BEL7402细胞株的生长抑制作用高于HepG2细胞，说明了As2O3对不同的肝癌细胞株的抑制作用存在差异，可能是由于这两株细胞生物学特性不同，还与临床肿瘤治疗学中强调的“个体化”即不同个体间的疗效预后存在差异相符［12］。
准确测定不同浓度的 As2O3对肝癌细胞株的体外抑制率，有利于指导联合用药，5.0 μmol/L As2O3联用1.0 mg/mL CDAII对HepG2的抑制率可达88%；对BEL7402的抑制率为100%。 As2O3可诱导肝癌细胞株向成熟方向分化使肿瘤细胞丧失其恶性生理学特征，发生凋亡。随着对As2O3抗癌机制的不断深入研究及安全性的提高，毒副作用的减少，As2O3必将为肝癌的治疗带来新的希望。
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