作者：郑敏 毛建文 王伟章 李明 李红枝 王丽京
【摘要】 目的 总结鸡胚组织免疫组织化学染色中的操作经验。方法 应用常规免疫组化方法对不同发育时期的鸡胚石蜡组织切片进行免疫组化染色。结果 免疫组化的方法检测早期鸡胚发育中的相关抗体的表达定位准确，背景清晰。结论 注意鸡胚免疫组化的操作要点，有助于提高鸡胚组织的免疫组化染色质量。
【关键词】 鸡胚;HE染色;免疫组织化学
鸡胚材料因其价格低廉、经济实用而具有重要的实验价值，广泛应用于肿瘤学、中药学等研究领域[1]。而免疫组化方法是常用的病理学技术，为科研和教学提供了直观的形态学支持[2]。但由于市面上针对鸡的特异性抗体较少，在做鸡胚的免疫组化时常用鼠、兔或人等市面上易于得到的抗体，因此常出现一些非特异性着色等问题。笔者在对不同时期的鸡胚石蜡组织切片进行常规的HE染色方法和免疫组化染色时，发现了一些鸡胚组织普遍存在的问题，针对这些问题进行了探讨，并提出了改进的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验室种蛋来源于华南农业大学种鸡场。鸡胚孵化第3～8天，每天取5～10枚。将鸡胚内容物移入结晶皿中，小心取出胚胎，用生理盐水冲洗。整胚浸入4%(φ)多聚甲醛固定4～24 h。常规石蜡包埋，5 μm/片石蜡切片。
1.2 方法
1.2.1 HE染色 切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水，苏木素染色1～2 min，自来水冲洗10 min，盐酸乙醇分化30 s，自来水冲洗5 min，水洗返蓝，伊红液染色30 s ～1 min。常规脱水，透明，中性树脂封片。
1.2.2 免疫组织化学染色 切片脱蜡至水，3% h3O2 室温孵育30～45 min;约95 ℃ 的枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中抗原热修复10～20 min;正常山羊血清封闭45 min后加一抗(兔抗神经纤维抗体， millipore)，工作浓度1∶200，4 ℃ 过夜;PBST洗涤3次，每次10 min;滴加HRP标记的二抗(山羊抗兔IgG，北京中杉公司)，工作浓度1∶100，37 ℃孵育30 min;PBST洗涤3次，每次10 min;DAB显色5～10 min;苏木素轻度复染，中性树脂封片。阴性对照不加一抗;阳性对照为小鼠脑石蜡切片。
2 结 果
对不同时期的鸡胚石蜡切片进行常规HE染色，结果发现鸡胚组织在不同的发育阶段具有不同的形态结构，即使同一时间段里鸡胚的发育也有一定的差异，这与鸡蛋受精的时间不同有关。由图1A可以看出，5日龄鸡胚组织的细胞核被苏木精染成淡蓝色，而细胞质呈粉红色至红色。同时还发现在鸡胚眼眶视网膜位置可见褐色的沙粒状颗粒。如图1A箭头所示。
对不同时期的鸡胚石蜡切片进行神经丝蛋白(NF)免疫组化染色，结果发现在较大日龄的鸡胚中才有少量表达且主要表达于鸡胚脊索神经元的胞浆内，呈不同程度淡黄色，细丝状，如图1B箭头所示(图1C为阳性对照：小鼠脑皮质神经元)。神经丝是构成神经元细胞骨架的主要成分之一[3]， 是神经细胞的中间丝，由L、M、H 3种蛋白组成。神经丝广泛存在于中枢和外周神经组织及其肿瘤中，是神经元的标志[4，5]，其功能与轴突的管径和神经传导速度有关[6]。在发育过程中，L和M在动物出生前数天开始表达，H则是在出生后才出现[7]。同时在鸡胚眼眶视网膜位置亦可见褐色的沙粒状颗粒，如图1D箭头所示，结果与HE染色结果相似。同时由于鸡胚早期发育过程中造血组织丰富，亦容易出现白细胞、单核细胞着色，见图1E、F。出现这些现象可能是由于漂洗片子时未洗干净或者用血清封闭得不够以及DAB显色时间太长等所致。后经过不断的摸索，对操作中的关键环节进行改进，如通过充分地漂洗，控制DAB显色时间，延长血清封闭时间，用3% h3O2 处理切片等，发现可以在一定程度上避免这些非特异性着色。如图1G、H、I箭头所示。
A.5日龄鸡胚组织HE染色中视网膜色素上皮细胞色素沉着(如图中箭头所示);B.神经丝蛋白(NF)在10日龄鸡胚脊索神经元中的表达; C.神经丝蛋白(NF)在小鼠脑皮质神经元中的表达;D.5日龄鸡胚组织NF免疫组化染色中视网膜色素上皮细胞色素沉着;E 、F.5日龄鸡胚组织NF免疫组化染色中红细胞、粒细胞和单核细胞着色;G.经改进实验方法后，5日龄鸡胚组织NF免疫组化染色中视网膜色素上皮细胞无明显色素沉着;H、I.经改进实验方法后，5日龄鸡胚组织NF免疫组化染色中红细胞、粒细胞和单核细胞无明显着色
3 讨 论
在进行鸡胚石蜡组织切片的HE染色和神经纤维抗体Neurofilament M免疫组化实验中，发现了鸡胚免疫组化过程中容易出现的一些问题，并根据这些问题提出改进的方法：
(1)特定部位易发生色素沉着：在HE染色和免疫组化中，发现在鸡胚头部常见深褐色的沙粒状颗粒环绕眼眶部位。极易误解为免疫组化的阳性反应。实际上是鸡胚视网膜色素上皮细胞吞噬了染液所致。鸡胚视网膜色素上皮细胞一般为单层矮柱状细胞。主要特点是胞质内含有大量粗大、圆形或卵圆形黑色素颗粒，胞质内可见吞噬体。因此具有很强的吞噬能力，易于吞噬染料而导致假阳性反应[8]。见图1A、D。可能是由于漂洗片子时未洗干净或者用血清封闭得不够以及DAB显色时间太长所致[9-11]。因此在染色前最好充分观察常规切片，了解HE 和免疫组化的染色情况，在操作过程中要注意充分地洗涤、切片。本实验中将 PBS漂洗的时间由常规的5 min改为10 min;同时在显微镜下控制显色时间为5～10 min，即可获得较为理想的免疫组化染色效果，见图1 G、H、I。否则背景易上色，见图1E、F。(2)易出现间质着色：鸡胚发育中间充质组织非常丰富，因此免疫组化时易出现间充质组织着色。间充质着色的原因很多，如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色，又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质，很容易与抗体结合，造成间质着色;抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色。遇到此种情况可以适当延长血清封闭时间，或选择单克隆抗体等以避免一些非特异型的结合。(3)易出现细胞质着色：胞浆着色局限在细胞内，间质无着色，看上去与真实的免疫反应着色几乎一样，很难区别。主要原因是发育中的鸡胚细胞胞浆里含有较多的蛋白质，还有内源酶，如红细胞中的血红蛋白、粒细胞、单核细胞中的细胞色素等。这种原因造成的着色，可以通过延长血清封闭和3%过氧化氢甲醇溶液处理切片的时间来解决。本研究将石蜡切片用3% h3O2处理的时间延长至45 min，同时将山羊血清封闭的时间延长至45～60 min后，发现可以减轻白细胞、粒细胞、单核细胞的着色，如图1H、I。(4)不适当的组织处理也可能出现细胞核着色，如组织在二甲苯或缓冲液里浸泡时间太长、操作过程中组织变干、微波修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下太少，未没过组织等。解决办法是应严格按照操作常规进行工作。还有一个因素是实验成败的关键:一抗的浓度是否合适，这关系到能否做出阳性结果。
总之，鸡胚材料虽然应用广泛，但鸡胚组织毕竟不同于一般成熟的组织，要想做出理想的免疫组化结果并不容易。因此在鸡胚免疫组化过程中，需根据鸡胚组织的特殊性，对常规的免疫组化染色方法中相关的步骤进行适当的调整，如延长PBST洗涤的时间，封闭时间以及3%双氧水甲醇溶液处理切片的时间等，才可有效地避免以上问题的出现，做出漂亮的免疫组化图片。
参考文献
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