吡硫醇聚乙二醇前药的合成与表征

　　　　　　　　 作者：张围宇，王红，蔡波涛，胡春

【摘要】 目的 合成吡硫醇聚乙二醇前体药物，对目标化合物进行初步体外释放及刺激性试验研究。方法 以单甲氧基聚乙二醇4000为原料，与丁二酸酐反应后再与N羟基丁二酰亚胺缩合得到活泼酯，最后与吡硫醇反应得到目标化合物；用薄层色谱、紫外、红外、核磁共振氢谱对其结构进行表征。结果与结论 合成产物的结构表征结果表明单甲氧基聚乙二醇4000成功地连接到了吡硫醇上；初步的体外降解及刺激性试验表明该前药具有一定缓释作用，且能显著减小对注射部位及血管的刺激作用。

【关键词】 吡硫醇;单甲氧基聚乙二醇;前药;结构表征

　　Abstract:Objective To synthesize and characterize pyritinolPEG prodrug， and assess its in vitro release and irritation. Methods mPEG4K was first reacted with succinic anhydride， and then treated with Nhydroxyl succinic anhydride， finally， reacted with pyritinol to give the target pyritinolPEG which is the prodrug of pyritinol. Results The chemical structure of pyritinolPEG was characterized by TLC，UV， FTIR and 1HNMR. Conclusion The structural characterization of the target compound showed that mPEG4K was bonded to pyritinol. This prodrug has slowrelease profile during in vitro release test， and significantly low vascular irritation.

　　Key words:pyritinol; methoxy polyethyleneglycol; prodrug; synthesis

　　高分子量的聚乙二醇及其单甲氧基聚乙二醇等由于其良好的水溶性、生物相容性和无免疫原性，以及无毒等优点，在前体药物的制备中有越来越多的应用［1-2］。吡硫醇临床上主要用于脑震荡综合症、脑外伤后遗症、脑炎及脑炎后遗症等的头胀痛、头晕、失眠、记忆力减退、注意力不集中、情绪变化等症状的改善，亦用于脑动脉硬化、老年痴呆等。临床主要用其盐酸盐，因其半衰期短，口服给药需每天3次，很不方便；静脉滴注时，药物对血管黏膜有刺激作用，易发生注射部位血管肿胀、疼痛、呈青紫色、树枝状及注射部位乃至整个上肢皮肤水肿、发硬、痒痛等不良反应。作者通过采用单甲氧基聚乙二醇的活化酯与吡硫醇合成前体药物［3-6］，以期改善吡硫醇药物半衰期短以及刺激性大的问题。

　　1 实验部分

　　1.1 仪器与试剂
　　
　　RE52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；78HW1型恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司)；SKFG01电热恒温鼓风干燥器(湖北省黄石市医疗器械厂)；SHBⅢ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；UV1700紫外可见分光光度计（日本岛津）；DFY低温恒温反应浴(郑州长城仪器有限公司)；WRSIB数字熔点仪(上海精密科学仪器公司)；PerkinElmer Spectrum 2000 FTIR光谱仪(美国PE公司)；AS600(600 MHz)高分辨率核磁共振仪；ZF6型三用紫外线分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)。
　　
　　药用单甲氧聚乙二醇4000(mPEG4K)(南京威尔化工有限公司)；吡硫醇(质量分数：98.5%，水分：0.17%，批号：080519，上海新云化工有限公司提供)；丁二酸酐、二环己基碳酰亚胺(DCC)、N羟基琥珀酰亚胺(NHS)、对二甲氨基吡啶(DMAP)、薄层层析硅胶GF254均为化学纯，N，N二甲基甲酰胺(DMF)、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醚、甲醇、吡啶、丙酮均为分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 单甲氧基聚乙二醇4000琥珀酸单酯(mPEG4KA)的合成

　　参照文献［7-8］进行合成试验研究。称取干燥的单甲氧基聚乙二醇4000（mPEG4000）40 g (10 mmoL)，溶于150 mL三氯甲烷中，加入丁二酸酐2.0 g(20 mmoL)和1.6 mL吡啶，加热回流反应48 h，减压回收溶剂，残余物中加入饱和NaHCO3溶液150 mL使溶解，过滤，用80 mL乙酸乙酯萃取2次，水相冷却至0 ℃后用2 mol/L的HCl酸化至pH 2左右，用二氯甲烷100 mL分3次萃取，合并二氯甲烷层，无水Na2SO4干燥过夜。滤去干燥剂，浓缩至粘稠，快速搅拌下加入冷无水乙醚300 mL，放入冰箱静置，待产品完全析出后过滤，抽干，P2O5干燥，称重，得mPEG4KS 35 g，产率为85%，mp 56.3～58.2 ℃。

　　1.2.2 吡硫醇聚乙二醇前药的合成

　　参照文献［9-10］进行合成试验研究。称取干燥的mPEG4KA 4.0 g(0.1 mmoL)，用50 mL DMF溶解，0～5 ℃搅拌20 min，依次加入NHS 0.23 g(0.2 mmoL)和DCC 0.62 g(0.3 mmoL)， 0～5 ℃搅拌10 min，依次加入吡硫醇 0.48 g(0.13 mmoL)和DMAP 0.16 g(0.13 mmoL)。0～5 ℃反应2 h，30～35 ℃下反应20 h，停止反应，反应液过滤，滤液在快速搅拌下加入冷乙醚180 mL，搅拌5 min后置冰箱中静置30 min。过滤得浅米黄色固体，将固体用30 mL水溶解，过滤，滤液用二氯甲烷萃取(35 mL×3)，用1 mol/L HCl洗涤(10 mL×2)后再用水洗(15 mL×2)。加入适量无水硫酸钠干燥，静置过夜。过滤干燥剂，滤液再用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液浓缩，快速搅拌下加入冷无水乙醚沉淀产物，过滤得浅米黄色粉末，40 ℃真空干燥24 h（干燥剂为P2O5），得浅米黄色粉末(吡硫醇的载药量4.89%)，mp 56.5～59.2 ℃。

　　2 结果与讨论

　　2.1 合成
　　
　　吡硫醇聚乙二醇前药的合成路线如下。

　　2.2 表征

　　2.2.1 熔点测定

　　用毛细管法对目标化合物与吡硫醇进行熔点测定，得目标化合物的熔点为56.5～59.2 ℃，明显低于吡硫醇的215.9～217.7 ℃，推断目标化合物是不同于吡硫醇的其他物质。

　　2.2.2 薄层色谱鉴别

　　称取吡硫醇、吡硫醇聚乙二醇前药，用DMF溶解，分别点样于同一硅胶板上，以丙酮石油醚甲醇(体积比1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254 nm)下检视，吡硫醇斑点与目标化合物斑点清晰，且两试样Rf值相差较大，说明目标化合物是不同于吡硫醇的其他物质。

　　2.2.3 紫外色谱鉴别

　　分别称取吡硫醇及目标化合物少量，溶于0.1 mol·L-1 HCl中，经适当稀释得一定浓度的溶液，分别在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描。结果：吡硫醇的0.1 mol·L-1 HCl溶液在295.20 nm有最大吸收，目标化合物的0.1 mol·L-1 HCl溶液在297.40 nm有最大吸收。结果表明:目标化合物具有吡硫醇分子的基本结构；最大吸收波长发生红移， mPEG已经连接在吡硫醇上。

　　2.2.4 红外光谱表征

　　将目标化合物和各步反应产物用压片法进行红外扫描，各图谱进行对比，得到目标化合物中可能的基团：3 525.40 cm-1(酚羟基伸缩振动)； 1 735.68 cm-1(酯羰基上羰基伸缩振动)；1 455.32 cm-1，1 349.52 cm-1，1 297.18 cm-1，949.67 cm-1(均为聚乙二醇骨架伸缩振动)；1108.25 cm-1(醚健不对称伸缩振动)；2 869.55 cm-1(吡啶环上碳氢伸缩振动)。表明mPEG已经连接在吡硫醇上。

　　2.2.5 核磁共振氢谱表征

　　由于mPEG4K的相对分子质量及氢的个数远超过所载的吡硫醇，所以在图谱上很难看到吡硫醇的氢信号，无法准确积分氢的个数。各氢的化学位移(δ)如下: 2.6～2.8 (—O—CO—Ch3—Ch3—CO—O—)，3.3～3.4(—OCH3)，3.4～3.8(—OCh3—)，4.2～4.3(—Ch3—O—CO—)。

　　2.3 初步体外释放及刺激性试验

　　2.3.1 体外释放试验

　　参照文献［11-12］采用透析袋与紫外分光光度法，分别在0.1 mol·L-1的HCl、0.1 mol·L-1的NaOH、及0.1 mol·L-1的pH7.2的磷酸盐缓冲液3种不同的环境中对吡硫醇聚乙二醇前药做了体外释放研究。结果：吡硫醇与单甲氧基聚乙二醇4000琥珀酸单酯的物理混合物在酸性、中性、碱性条件下，24 h释放率均达90%以上；吡硫醇聚乙二醇前药24 h后的降解情况分别为酸性条件下释放36%、碱性条件下53%、中性条件下26%；前药在不同条件下的释放速率大小为：碱性＞酸性＞中性。

　　2.3.2 刺激性试验

　　 参照文献［13-14］，通过小鼠抓挠试验、大鼠舔足试验、大鼠尾静脉刺激性试验对吡硫醇聚乙二醇前药做初步刺激性考察。小鼠抓挠试验结果：供试组与阳性对照组、阴性对照组比较差异均有显著性（P<0.01）。大鼠舔足试验结果：供试组与阳性对照组比较差异有显著性（P<0.05），供试组与阴性对照组比较差异有显著性（P<0.01）。大鼠尾静脉刺激性试验结果：供试组的刺激性与阳性对照组比较显著减小。

　　3 结 论
　　
　　本研究合成了吡硫醇聚乙二醇前药，经熔点测定、薄层色谱、紫外图谱、红外光谱、核磁共振氢谱表征，表明mPEG4K成功地连接到了吡硫醇上。通过初步的体外降解及刺激性试验，该前药具有一定缓释作用，且能显著减小在注射过程中对注射部位及血管的刺激作用。

参考文献

　［1］GREENWALD RB， CHOE YH，MCGUIRE J，et al. Effective drug delivery by pegylated drug conjugates［J］. Advan Drug Deliv Rev，2003，55(2):217-250.

　　［2］GREENWALD RB. PEG drugs: an overview［J］. J Controll Releas，2001，74(2):159-171.

　　［3］ABUCHOWSKI A，MCCOY R R，PALCZUK N C.Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase［J］. J Biol Chem，1977，252(11):3582-3586.

　　［4］ABUCHOWSKI A， VAN ES T， PALCZUK N C. Alteration of immunological proprties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol［J］. J Biol Chem，1977，252(11):3578-3581.

　　［5］公伟，薛春佳，冯军，等.单甲氧基聚乙二醇修饰L门冬酰胺酶的研究［J］.中国医药工业杂志，2005，38（5）：336-339.

　　［6］LEE H，PARK TG. Preparation and characterization of monoPEGylated ipidermal growth factor: evalution of in vitro biologic activity［J］. Pharm Res，2002，19(6):845-851.

　　［7］熊成东，王亚辉，袁明龙，等.聚乙二醇衍生物的合成研究进展［J］.高分子通报，2003，26（1）：39-43.

　　［8］YUKIO N，KAZUNORI K，MASAO K， et al. Poly(ehylene glycol )and cyclodextrin as novel building units for molecular assembly and polyrotaxanes［J］. Polym Prepr，1997，38(2):529-533.

　　［9］叶海，张灿，沈文斌，等.灯盏乙素聚乙二醇前药的合成与表征［J］.中国天然药物，2006，4(4):283-286.

　　［10］GRENWALD RB，PENDRI A，CONOVER C，et al. Drug deliver systems:2，Camptothecin 20Opoly(ethlene glycol)ester transport forms［J］. J Med Chem，1996，39(20):1938-1940.

　　［11］常军，郑玉斌，段久芳，等.含5氟尿嘧啶的聚乙二醇酯的制备与表征［J］.现代化工，2006，26（3）：40-42.

　　［12］孟繁娜，唐星，符纯美.盐酸吡硫醇无痛型注射液的制备［J］.沈阳药科大学学报，2006，23(12):754-756.

　　［13］LOVELL M W. Lesspainful emulsion formulations for intravenous administration of clarithromycin［J］. Int J Pharm，1994，109:45-57.

　　［14］CANNON J B. Reduction of pain on intravenous infusion with bile salt formulations for a macrolide antibiotic［J］. Int J Pharm，1995，114:65-74.