促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)在大肠杆菌中的表达和纯化

【摘要】 目的 用大肠杆菌表达重组人促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)蛋白，为hTSHR膜外区的研究提供工具。方法 从人甲状腺组织中提取总RNA，RTPCR分离得到TSHR膜外区cDNA，双酶切后插入原核表达载体pRSET C中， 进行序列分析;再转化到表达菌BL21中表达、 纯化、Western blotting 分析。结果 经SDSPAGE电泳有一条明显的蛋白带，与预期分子量相符，并用Western blot证实; 纯化后，获得单一条带的靶蛋白。结论 成功获得高纯度人TSHR膜外区蛋白。

【关键词】 人TSHR膜外区；RTPCR; 蛋白质纯化

　　Abstract:Objective To express and purify human thyrotropin receptor ectodomain （hTSHRECD） for further functional study.Methods Total RNA was isolated from human thyroid， hTSHRECD cDNA was obtained with RTPCR technique， subcloned into the plasmid pRSET C，and expressed in a soluble form in E. Coli BL21.Results There was an obvious band in SDSPAGE electrophoresis， whose molecular weight was equal to that we designed. Western blot proved the expressed product was hTSHRECD protein.Conclusion High pure target protein，hTSHRECD，was obtained.

　　Key words:human TSHRECD; RTPCR; purify protein

　　促甲状腺激素（thyroidstimulating hormone， TSH）是由垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素，主要作用的靶器官是甲状腺，它与甲状腺细胞膜上特异的受体即促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor， TSHR)结合后，提高甲状腺的摄碘能力，并促进甲状腺激素的合成和释放，对甲状腺组织的生长、分化等起着非常重要的作用。在自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease， AITD)发病过程中，促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor， TSHR)是重要的自身抗原［1］，机体产生针对TSHR的自身抗体(thyrotropin receptor antibody， TRAb)是其主要的发病机制。由于存在于甲状腺细胞膜上的TSHR数量少，结构不稳定，且难以纯化，无法开展TSHR的进一步研究。本研究从人甲状腺中提取RNA，通过逆转录获得TSHR膜外区cDNA，构建原核表达载体，成功表达和纯化高纯度人TSHR膜外区蛋白。

　　1 材料与方法

　　1.1 组织来源和实验材料
　　
　　甲状腺组织来源于已确诊的Graves手术患者。大肠杆菌DH5α和BL21购于北京鼎国生物技术有限公司;限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA连接酶及T克隆载体试剂盒pMD18T系日本TaKaRa产品;原核表达载体pRSETc和Ni2+NTA悬液系美国Invitrogen公司产品; Total RNA Isolation System、Access RTPCR System、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和发光试剂盒为Promega公司产品;兔抗TSHR是上海亚培生物科技有限公司产品;质粒提取及凝胶回收试剂盒为上海博亚生物公司产品。

　　1.2 PCR引物的设计合成
　　
　　根据文献报告人促甲状腺激素受体cDNA 序列资料［2］，由上海华诺生物科技有限公司设计并合成一对用于扩增 hTSHR 膜外区cDNA 编码区的寡核苷酸特异性引物：上游引物为5′CAACTCGAG ACCATGCTGGGCGGAATGGGGTGTTCG3′，它包涵有转录启动子、Kozak系列和Xho Ⅰ酶切位点;下游引物为5′TACGAATTCCTACAGGAACTTGTAGCCCAT TAT3′， 它包涵有转录终止子和EcoR Ⅰ酶切位点。

　　1.3 总RNA的提取和RTPCR
　　
　　冻存的约100 mg甲状腺组织在盛有液氮的研钵中充分破碎，研磨成匀浆，按试剂盒说明逐步加入裂解液醋酸钠、酚氯仿异丙醇，抽提组织中的总RNA，经乙醇漂洗后溶于无RNA酶灭菌去离子水。利用分光光度器测定RNA的A260和A280值。RNA样品预处理于75 ℃变性5 min后速放冰上冷却。RTPCR反应体系：AMV反转录酶(5 u/μL)1 μL， DNA聚合酶(5 u/μL)1 μL，5×AMV/ Buffer 10 μL，上下游引物各3 μL，最后混合RNA样品加无RNA酶灭菌去离子水至50 μL。混匀后置PCR仪上，逆转录反应条件设为：48 ℃逆转录60 min，94 ℃预变性2 min。PCR反应条件为：94 ℃变性30 s，60 ℃退火60 s，68 ℃延伸270 s，45个循环后，68 ℃终延伸10 min。对RTPCR产物经乙醇沉淀法进行纯化浓缩。

　　1.4 克隆质粒和原核表达载体的构建及鉴定
　　
　　促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)在大肠杆菌中的表达和纯化根据TA克隆原理［3］，将TSHR膜外区片段插入pMD18T克隆载体。将TSHR膜外区(thyrotropin receptor ectodomain， TSHRECD)片段3 μL(约75 ng DNA)，TA克隆载体1 μL(约50 ng DNA)，T4 DNA连接酶0.5 μL，10×连接酶缓冲液5 μL，加去离子水至10 μL，至PCR仪上16 ℃过夜。将连接产物转入DH5α细菌，经IGTP/Xgal平皿(Amp+)筛选，挑选单个阳性菌落，放入10 mL LB培养液中，37 ℃振摇过夜。碱裂解法提取重组质粒，双酶切法筛选携带目的片段的阳性克隆子并纯化。将提纯的pMD18T ETSHR重组质粒双酶切后，定向插入质粒。反应体系为pMD18TTSHRECD重组质粒5 μL，10× Buffer 2 μL，Xho Ⅰ和EcoRⅠ各1 μL，加水至10 μL。将酶切体系37 ℃过夜，65 ℃ 15 min灭活内切酶。经凝胶电泳后分离目的片段ETSHR，提纯浓缩后加入原核表达载体pRSETC(EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切)，再建立连接体系。连接产物导入感受态细胞，涂于琼脂平板(Amp+)，挑选阳性克隆，EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ酶切鉴定分析后，送上海华诺生物科技公司测序。测序正确质粒命名为pRSETcTSHRECD。

　　1.5 TSHRECD融合蛋白的诱导表达
　　
　　将重组质粒pRSETcTSHRECD转化感受态细菌BL21，氨苄青霉素筛选阳性克隆。挑取单个菌落，接种于5 mL LB培养基中（含氨苄青霉素），于37 ℃摇床过夜。次日，按1∶100转种于500 mL LB培养基中，37 ℃振荡培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度1 mmol/L， 32 ℃诱导振荡培养4 h，离心收集菌体，SDSPAGE分析重组蛋白的表达。

　　1.6 融合蛋白的纯化

　　将1 mＬ Ni2+NTA悬液和4 mＬ细菌裂解上清液轻轻混匀，4 ℃放置60 min，直接过柱，过柱结束后，用4 mＬ漂洗液（20 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠pH8.0），洗脱未和Ni2+结合的杂蛋白，经过2次漂洗后，再用0.5 mＬ洗脱液（250 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠pH8.0）3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集，取收集液，进行SDSPAGE分析。

　　1.7 融合蛋白Western blot 检测
　　
　　取细菌裂解上清液加等量2×SDS上样缓冲液在SDSPAGE凝胶上电泳，然后电转膜到醋酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭，以兔抗TSHR（1∶5 000）为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶500)为二抗进行抗原抗体反应，发光试剂盒显色。

　　2 结 果

　　2.1 TSHR膜外区基因片段的扩增
　　
　　从Graves手术患者甲状腺组织提取总RNA并反转录成cDNA，利用合成的特异引物进行RTPCR扩增，得到约1 232 bp扩增产物，与目的基因大小相符。

　　2.2 重组表达质粒pRSETcTSHRECD的鉴定
　　
　　将所得TSHR膜外区基因片段克隆入表达载体pRSETc中， 构建好的质粒经双酶切鉴定， 可见约1 224 bp基因片段，见图1。测序结果与GenBank中TSHR膜外区基因序比较，两者完全一致，表明重组表达质粒pRSETcTSHRECD构建成功。

　　2.3 TSHR膜外区蛋白的表达及纯化
　　
　　经过条件的摸索，在A600约0.6～0.8，IPTG浓度为1 mmol/L， 32 ℃诱导振荡培养4 h时，蛋白得到了大量可溶表达，经过SDSPAGE分析见相对分子量约为 47 kD的蛋白带，TSHR膜外区蛋白经过Ni2+NTA亲合层析纯化，得到单一条带的靶蛋白，与预期分子量相符，见图2。

　　2.4 融合蛋白的Western blot结果
　　
　　显色后，约为 47 kD处出现条带，与预期的所要表达的6×His融合TSHRECD蛋白大小相符，表明目的蛋白在大肠杆菌中得到有效表达，见图3。

　　3 讨 论
　　
　　人促甲状腺素受体(hTSHR)是一种膜蛋白，主要存在于甲状腺滤泡细胞(TEC)膜上。生理情况下，hTSHR与促甲状腺素(TSH)结合，调节甲状腺滤泡细胞的正常功能和生长。hTSHR为G蛋白偶联的大分子糖蛋白，分为膜外区、跨膜区和膜内区3部分， 膜外区非常大，由397个氨基酸残基组成;由于不明原因，TSHR膜外区容易发生裂解和脱落而进入血流，触发和增强了TSHR的自身免疫，引起甲状腺功能亢进的发生［4］。国外学者用体外重组得到的TSHR膜外区纯化蛋白，可成功诱导甲亢模型［5］。因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论意义; 在国内，有文献提及原核表达载体的构建和蛋白的表达［6，7］。
　　
　　本实验采用了原核表达载体pRSETc， 该载体有2个特点:一是含有T7启动子， 可被T7 RNA聚合酶识别， T7 RNA聚合酶转录效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍，能够高效转录mRNA， 大量表达目的蛋白。二是载体上仅携带有6个His残基，对目的蛋白的结构和生物学影响很小，而且便于纯化。本研究成功构建TSHR膜外区原核表达质粒， 以可溶蛋白形式获得较高表达， 通过Ni2+NTA柱纯化，获得纯化的目标融合蛋白质，为研究Graves′甲亢的发病机制，探索新的诊断方法及免疫学治疗提供新的工具。

参考文献

　［1］BROWN R S. Minireview: developmental regulation of thyrotropin receptor gene expression in the fetal and newborn thyroid［J］. Endocrinology， 2004， 145(9):4058-4061.

　　［2］MISRAHI M， LOOSFELT H， ATGER M， et al. Cloning， sequencing and expression of human TSH receptor［J］. Biochem Biophys Res Commun， 1990， 166(1):394-403.

　　［3］萨姆布鲁克. 分子克隆实验指南 ［M］. 3 版. 北京：北京科学出版社， 2002:960-961.

　　［4］CHEN C R， PICHURIN P， NAGAYAMA Y， et al. The thyrotropin receptor autoantigen in Graves disease is the culprit as well as the victim［J］. J Clin Invest， 2003，111(12):1897-1904.

　　［5］SEETHARAMAIAH G S. Animal models of Graves hyperthyroidism［J］. Autoimmunity， 2003，36(6-7):381-387.

　　［6］吴晓燕，雒文田，徐利，等. 人促甲状腺激素受体胞外段高效表达质粒的构建、表达及蛋白纯化［J］.中华内分泌代谢杂志，2004，20（5）：470-47.

　　［7］武敏，施秉银，伍丽萍，等.人TSHR膜外区cDNA克隆及真核表达载体构建［J］.西安交通大学学报: 医学版，2007，28（2）：123-125.