天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定

【摘要】 目的 构建库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体（ScFv)库，为进一步筛选ScFv奠定基础。 方法 从健康自愿者的外周血淋巴细胞提取mRNA，经RTPCR分别扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)DNA，进而连接形成ScFv DNA。将其连接TVector转化E.coli JM109大肠埃希菌，经蓝白筛选，挑取9个阳性克隆测序以鉴定ScFv组装。通过体外转录和翻译对抗体文库进行初步鉴定。 结果 VH、VL和ScFv DNA分别约为350、650和1 100 bp。本试验成功构建ScFv核糖体展示模板。 结论 成功构建天然的大容量核糖体展示人源性ScFv文库，为下一步利用亲和富集筛选技术获得各类ScFv奠定基础。

【关键词】 抗体； 单克隆； 核糖体； 埃希氏菌属； 基因文库

单链抗体(SingleChain fragment variant，ScFv)是通过基因工程技术方法把重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)连接而构建的重组蛋白，较之完整抗体具有分子量小、通透性高等特点，更适合用于药物靶向和免疫生物治疗。构建ScFv可通过传统的杂交瘤技术或噬菌体展示技术制备，而近年来问世的核糖体展示技术(ribosomal display，RD)是一种不受细胞转染和表达等因素影响的完全细胞外展示系统工程[1]，简化了ScFv的筛选过程，可望筛选到高亲和力的ScFv。本研究选用健康自愿者的外周血淋巴细胞为材料，构建天然大容量核糖体展示ScFv文库，为下一步筛选各类ScFv奠定基础。

1 材料与方法

　　1.1 材料和试剂 mRNA提取试剂盒（瑞典Amersham公司）；Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，兔网织红细胞裂解液，T7 RNA聚合酶，rNTPs RNase inhibitor（美国Promega公司）；pMD18 TVector载体（日本Takara公司）；RNA抽提试剂盒（瑞士Roche公司）；脂多糖（LPS，美国SigmaAldrich集团公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 mRNA提取和RTPCR 抽取10位健康志愿者外周血，其中男性5例，女性5例，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。按mRNA提取试剂盒(Amersham)说明书所述步骤提取mRNA。以Oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA，具体方法按说明书进行。

　　1.2.2 ScFv DNA的构建及扩增 利用mRNA反转录合成cDNA第1链，以第1链为模板，扩增抗体基因按文献扩增人类主要的轻重链可变区基因，所有引物序列根据抗体两端相对保守的框架区设计[23]。所需引物和寡核甘酸均由上海生工负责合成。

　　扩增重链VH可变区引物为：

　　VH/T7（上游）：5’GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATGAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG3’

　　Vh3（下游）：5’TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC3’

　　其中划线部分为T7启动子序列；黑体部分所示为核糖体结合位点。扩增VL可变区引物为：

　　VL（上游）：5’ATTGAGCTCACCCAGTCTCCA3’

　　Ck（下游）：5’GAACACTCATTCCTGTTGGAGCT3’

　　引物中的简并碱基符号M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，按程序1(30个循环:94 ℃×1 min→55 ℃×2 min→72 ℃×2 min)进行PCR，分别扩增VH和VL cDNA ，对扩增产物进行纯化并测定其浓度。Linker序列为(Gly4Ser)3，该引物两端的各18个碱基分别与VH和VL基因的3’端和5’端相互补。将VH、VL和Linker等量混合后，经程序2(7个循环: 94 ℃×1 min→63 ℃×4 min)进行聚合反应使VH和VL籍linker DNA连接形成ScFv DNA。然后通过引物Vh3和CK进行PCR扩增，执行程序1，使聚合的ScFv DNA得到扩增。

　　1.2.3 核糖体展示抗体库的构建 将最后纯化的核糖体ScFv展示模板连接TVector，用Bio Rad电转化仪将连接产物转化入E.coli JM109，通过蓝白筛选，随机挑取9个克隆子，进行菌落PCR法验证。将验证阳性的克隆子测序，分析序列，以此评价文库序列的多样性。

　　1.2.4 核糖体展示抗体库的初步鉴定 将PCR扩增的随机ScFv DNA文库进行离体转录（终浓度/100 μL：1×转录Bufffer、10 mmol/L DTT、100 U RNase inhibitor、0.75 mmol/L rNTPs、40 U T7 RNA聚合酶、2 μg随机DNA文库），37 ℃反应2 h，回收mRNA。转录产物再用兔网织红细胞裂解液系统进行离体翻译（50 μL的体积加入兔网织红细胞裂解液35 μL、1 mmol/L不含亮氨酸的氨基酸复合物0.5 μL、1 mmol/L不含甲硫氨酸的氨基酸复合物0.5 μL、40U RNase 抑制剂1.0 μL、mRNA 2 μg）30 ℃培育30 min，于冰上放置。

　　将体外翻译完成的产物立即从30 ℃拿出，加入冰冷的PBSMB溶液，轻轻混匀后，加入已用LPS封闭好预冷的酶联板中，每孔50 μL，冰上放置1～2 h。用PBSTM（1×PBST缓冲液中含5 mmol/L MgCl2）冲洗3遍，每次5 min，然后用PBSM（1×PBS缓冲液中含5 mmol/L MgCl2）冲洗2遍，每次5 min。加入EB缓冲液(1×PBS缓冲液中含20 mmol/L EDTA)，冰上放置10 min，吸取上清。重复此步骤1次。将收集的上清用RNA抽提试剂盒(Roche)提取上清中的RNA，引物VH/T7和Ck反转录扩增RNA得到一轮筛选后的ScFv DNA文库。将DNA文库又进行体外转录、翻译、筛选，重复2次。得到3次筛选后的ScFv DNA文库。分别以回收的RNA为模板进行RTPCR。

2 结 果

　　2.1 VH、VL 及 ScFv DNA的扩增结果 扩增得到的VH和VL DNA分别约为350 bp和650 bp，VH、VL和 linker连接后的ScFv片段大小为1.1 kb左右。将大量扩增的ScFv DNA通过琼脂糖凝胶电泳回收纯化，保存于-20 ℃（图1）。

　　2.2 核糖体展示ScFv文库的构建及分析 将菌落PCR验证为阳性的9个克隆子测序。结果表明，克隆的9条ScFv序列都是完整的，为开放阅读框，内部没有终止密码子。通过VBASE DNAplot 软件分析9条ScFv序列，其重链分别属于VH1，VH3，VH5，VH4基因家簇，轻链分别属于VKⅠ，VKⅡ，VKⅢ亚基因家簇。根据Kabat软件分析，9条序列的重链和轻链CDRs（互补决定区）也均有不同程度的变化。

　　2.3 核糖体展示ScFv文库的初步鉴定 将每轮回收得到的RNA各取2 μL进行RTPCR扩增，扩增结果见图2。从图中可以看出，第一轮筛选后回收的mRNA进行RTPCR扩增，得到一条非常微弱的条带。而经过3轮筛选后，得到非常明亮的扩增条带。

3 讨 论

　　RD是蛋白质筛选的重要工具，已用于筛选配体、受体，确定抗原表位，开发新的蛋白酶抑制物和新的药物等。该技术的特点是：正确折叠的完全蛋白和编码它的mRNA，同时结合在核糖体上，利用抗原抗体特异性结合的特点，便于蛋白富集，便于抗体文库筛选，是一种无细胞系统的蛋白质改造技术，可分为真核和原核RD。真核系统较原核系统有一定的优越性，原核系统受内源RNase的影响较大，生成的mRNA容易降解，而真核系统受内源RNase的影响较小。另外真核系统有利于提高某些蛋白质的翻译和折叠效率[4]。因此在本研究中笔者采用真核RD。核糖体展示完全在体外进行，弥补了噬菌体展示、细菌表面展示、酵母表面展示)等细胞内展示的不足，显著增强了库容量及分子多样性，库容量可以达到1013～1015，比噬菌体展示文库(约109)提高了104～106倍[5]。

　　有研究表明合理的ScFv应有一个连接VH和VL的柔性序列，通常是(Gly4Ser)3，而且VH和VL两功能域的排序应是VH在上游，VL在下游。否则，ScFv不仅活性极差，而且难于诱导免疫应答[6]。鉴于此，笔者所构建的ScFv也按上述顺序排列。互补决定区(CDRs)在抗原抗体特异性结合方面起着重要作用，CDRs的多样化意味着不同抗原特异性多样化。从实验结果可以看出，所构建的ScFv DNA文库序列是完整而多样的，可用于进一步进行特异性抗原的筛选。在本实验中，以LPS作为抗原进行了三联复合体的筛选。经过3轮筛选后扩增得到的DNA条带明显比只经过一轮筛选后扩增的DNA条带强，说明在RD过程中，能与LPS特异性抗原相结合的ScFv基因得到了显著的富集。表明构建的核糖体展示文库是成功的，为进一步的ScFv筛选奠定了坚实的基础。

参考文献

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[3] 吴红艳，章晓联，潘 勤. 利用核糖体展示文库初步筛选与伤寒杆菌Ⅳ型纤毛结合的细胞受体[J]. 生物技术通讯， 2004，15（4）:319322.

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[6] 朱 毅，朱 进，冯振卿，等. 日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48 单特异性双链抗体的构建表达与初步鉴定[J]. 中国血吸虫病防治杂志， 2005，17(4):241245.