壳聚糖凝胶的温敏性及其药物缓释性能研究

　　　　　　 作者：林友文， 方圆圆， 孟晓丹

【摘要】 目的 研究壳聚糖/甘油磷酸钠(CS/GPS)水凝胶的温敏性及载药凝胶缓释性能。 方法 试管倒置法研究不同配比、不同pH对CS/GPS体系凝胶化性能的影响；红外光谱表征CS/GPS复合物；紫外分光光度法考察温敏凝胶相变动力学曲线，并测定载药凝胶的累积释放度。 结果 56% GPS与2% CS体积配比从0.2增到0.8（混合液pH 6.5），在37 ℃下凝胶化时间(GT)从10 min缩短到1.5 min；56% GPS/2% CS体积比为0.4的混合液，pH 6.5升至7.0，37 ℃下GT从120 s减少到90 s；56% GPS与 2% CS以体积配比为0.2时（混合液pH 6.9），在25 ℃时维持液相，温度从30 ℃升至45 ℃，GT从9 min降至1 min，在37℃时，可快速凝胶化（GT为130 s）。依诺沙星为模型药物，载药凝胶12 h累积释放度为62%，依诺沙星原药3 h累积释放度达到97%。 结论 一定配比CS/GPS体系在37 ℃具有快速凝胶化特性，温敏性载药凝胶对药物具有缓释作用。

【关键词】 壳聚糖； 水凝胶类； 依诺沙星； 迟效制剂； 生物相容性材料

近年来，基于温度敏感性的在体原位凝胶给药系统成为药剂学及生物材料领域研究的热点[13]，其特点是以液体给药后，在药用部位因温度变化刺激（体温37 ℃）而发生相转变，固化或形成凝胶，从而控制药物的释放。可用于眼部给药、鼻腔给药、局部注射给药等[4]，可有效改善药物的生物利用度，也可作组织修复植入给药[56]。用于温敏凝胶给药系统的高聚物主要有聚N异丙烯酰胺、聚乙二醇/交酯(PEG/PLGA)嵌段共聚物、泊洛沙姆和壳聚糖（2氨基2脱氧βD葡萄糖，chitosan，CS）等[3，79]，其中CS为天然阳离子多糖，具有良好生物相溶性、可生物降解性、来源丰富等特点，在药物控释、智能生物材料等方面具有良好的应用前景。研究发现CS/甘油磷酸钠体系（Glycerphosphate，GPS）水凝胶具有温敏性，并用于药物控释系统，但有些配方在37 ℃下凝胶化时间较长（最短的是50 min）[10]，在临床应用上有一定的局限性。笔者研究在37 ℃下可快速凝胶化的CS/GPS体系，并以依诺沙星为模型药物，考察载药凝胶的体外药物释放行为。

1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 试剂 CS（大连鑫蝶甲壳素有限公司，脱乙酰度95%，分子量50 000），GPS（美国Alfa Aesar公司），依诺沙星（福建建东药厂，批号20061109），其他试剂均为分析纯（上海化学试剂公司）。

　　1.1.2 仪器 超级恒温器(501型，上海实验仪器厂有限公司)，精密pH计（pHS3B，深圳市誉达科技有限公司），恒温振荡器(SHAB型，南京安铎贸易有限责任公司），可见紫外分光光度计（UV9200，南京昕航科学仪器有限公司），红外光谱仪（Avatar 330FTIR，Thermo Nicolet公司），电子分析天平（AL104，梅特勒托利多仪器上海有限公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 CS/GPS体系温敏性实验 2 g CS溶解在100 mL盐酸(0.1 mol/L)溶液中，配制成的2% CS溶液，移取一定体积的2% CS溶液于试管中，按比例逐滴加入56% GPS溶液，振荡混匀后，以少量的NaOH稀溶液（0.02 mol/L）调节混合液的pH值。放入水浴恒温器恒温，参照文献[11]用试管倒置法研究GPS/CS配比、pH及温度等条件对CS/GPS体系凝胶化性能的影响。观察凝胶化现象，记录凝胶化时间(GT)。

　　1.2.2 CS/GPS体系凝胶相变动力学曲线 移取一定体积的2% CS溶液于试管中，按比例逐滴加入56% GPS溶液，振荡混匀后，以少量的NaOH稀溶液（0.02 mol/L）调节混合液pH 6.9，混合液转入比色皿中，装有混

3 讨 论

　　CS是甲壳素脱乙酰基后得到的天然线性高分子，在生物医用材料、药物制剂方面应用日趋广泛[12，9]。CS内富含氨基和羟基，可形成氢键，因此CS不溶于水和有机溶剂。在酸性溶液中CS上的碱性氨基能够质子化形成NH3+，使CS分子链间带同种电荷而相互排斥，CS分子可溶于（稀）酸溶液中。

　　GPS为弱碱性化合物(pKa 6.34)，结构中存在羟基和磷酸根负离子，是对人体安全的双官能团阴离子偶联剂，磷酸根负离子可与壳聚糖的质子化氨基NH3+通过静电引力作用交联，使壳聚糖溶液产生凝胶化，形成三维凝胶网络。凝胶网络的形成与环境温度有关，凝胶机理一般是认为与凝胶中存在的静电作用，氢键及亲、疏水平衡有关[1，14]。

　　GPS与CS二者间存在着三类型的相互作用力平衡，一是CS链间的静电斥力及CS与GPS的静电引力平衡；二是氢键作用平衡，如CS链间氢键作用、CS与GPS间、CS与水的氢键作用；三是CS的疏水作用。这些相互作用力的平衡都会随温度的改变而改变，CS/GPS水凝胶体系从而表现出温度敏感性[1]。

　　加入弱碱性的GPS，可部分中和壳聚糖NH3+，削弱了CS分子链间的静电斥力及与水的氢键作用。加适量的GPS时，在低温（25 ℃）下，因壳聚糖与水的氢键作用仍较强，加上GPS位阻作用，阻止了壳聚糖链的凝胶化交联。但随着温度升高，NH3+质子热运动增加，弱碱性的GPS可以成功地夺取NH3+上的质子，使CS的NH3+数量进一步下降，CS分子链间氢键作用增强，同时CS与水之间氢键作用减弱，疏水作用占主导地位，于是CS分子链出现交联形成凝胶[15]。透光率随温度变化的凝胶动力学曲线显示，在37 ℃附近透光率急剧降低，并出现拐点，出现凝胶化。凝胶化复合物的IR光谱与CS、GPS的IR谱图比较，吸收峰的变化和位移说明二者不是简单的物理混合，GPS与CS之间存在偶极静电作用（磷酸根和CS的质子化氨基）以及羟基间的氢键作用，也从另一方面说明凝胶机理与CS/GPS混合液存在的静电作用，氢键及疏水平衡有关。

　　随着GPS用量比的增加，GPS夺取更多NH3+质子，加速CS链间静电斥力减弱，使CS/GPS溶液在37℃下凝胶化时间减少，或在较低的温度下就可以凝胶化。但用量增大到一定时（如56%GPS与2%CS等体积混合），因中和电荷、溶液碱性提高及溶解达到饱和等诸多因素使混合液中的CS沉淀析出。

　　显然，pH值对凝胶化也有影响。一定的pH值范围内，升高CS/GPS的pH值，溶液中质子减少，则游离氨基多，CS链间静电斥力减小，分子链间氢键作用增强，使CS/GPS在37 ℃时的凝胶化时间也减少（图2）。当pH≥7.2时，因CS的溶解性降低而沉淀析出。而当pH值较低时（pH<4），氨基质子化程度高，同时抑制GPS磷酸质子解离，CS链以静电排斥占主导，不易交联凝胶化。

　　具有温度敏感性的给药系统，载药凝胶缓慢地、持续地释放药物，长时间与作用部位发生紧密接触并吸收药物，避开首过效应，提高药物的生物利用度；可减少给药次数，延长药物生物半衰期，增加药物疗效。

　　在温度敏感性原位凝胶给药系统的实际应用中，既要求体系具有在生理温度（37 ℃）快速凝胶化的特性，又要求在常温（25 ℃）时保持液相制剂的稳定。本实验选用56% GPS/2%CS体积配比为0.2，常温时可持续保持液相，30 min内未出现凝胶化，当温度升高至37 ℃时，凝胶化时间为130 s，适合于载药实验及缓释性能考察。结果载药凝胶12 h累积释放度为62%，依诺沙星原药3 h累积释放度达到97%，实验结果表明CS/GPS凝胶体系对药物依诺沙星有明显的缓释作用。其药物缓释时间较其它凝胶骨架体系对药物的缓释时间（数天）短，这是因为这种温敏凝胶含水量大，具有较大的网络孔道，小分子药物较易通过凝胶网络孔道扩散逸出，文献报道小分子亲水性药物在此系统中数h可完全释放[16]。此外，药物在此凝胶系统的释放速度还与药物相对分子质量的大小有关[2]。

　　本实验中不同配比的CS/GPS体系在37 ℃时均有快速凝胶化的特性（GT为75～130 s），CS和GPS均具有良好的生物相容性，温敏性载药凝胶对药物具有缓释作用，CS/GPS是温度敏感性给药系统的理想载体。

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合液的比色皿放入水浴恒温器恒温3 min后，取出用擦镜纸快速擦干，参照文献[12]分光光度法，λ450nm处测定CS/GPS混合溶液的透光率随温度变化，绘制凝胶相变动力学曲线。对照样品2% CS溶液同法测定。

　　1.2.3 红外光谱表征 凝胶化的CS/GPS复合物进行过滤，烘干，研磨，KBr压片，红外光谱检测。

　　1.2.4 载药凝胶的制备及体外药物释放实验 精确称取一定量依诺沙星于试管中，加入2% CS溶液，振荡使药物溶解后，逐滴加入56%GPS并混匀，37 ℃水浴加热使其凝胶化，制成载药凝胶。同法制备空白凝胶（不加依诺沙星）。分别配制不同浓度的依诺沙星标准溶液， 参照文献[13]在分光光度计测定λ262nm处测其吸光度值A，以浓度(C)吸光值(A)作标准曲线，进行线性回归得到的拟合方程为:

　　A=0.097×C-0.0069(R2=0.999)

　　将一定量载药凝胶小心地从试管中移至一端已封口的透析袋中，PBS 5 mL（pH 7.4）淋洗试管，淋洗液转入透析袋中，并扎紧另一端封口。将透析袋放入装有PBS（pH 7.4）195 mL的锥形瓶中。将此锥形瓶放入振荡器中，恒温37 ℃，调转速100 r/min进行实验。定时取样3 mL（并及时补充37 ℃的PBS 3 mL，维持介质总体积为200 mL），将各时间点的样品以PBS为对照，在波长262 nm处测定各时间点处的吸光值A1。同时测定空白凝胶的吸光值A2，载药凝胶中药物吸光值A=A1-A2，代入标准曲线计算浓度C，求各时间点处载药凝胶中药物累积释放度（%）。同法测定依诺沙星原料药在相同条件下体外释放的累积释放度（%）。平行实验3次，以x±s表示。

2 结 果

　　2.1 GPS/CS配比对凝胶化时间影响 56% GPS与2% CS体积配比从0.2增加到0.8（混合液pH 6.5），在37 ℃下GT从10 min缩短到1.5 min（图1）。随着GPS用量的增加，GT减少，但2%CS与56%GPS等体积混合时析出沉淀。

　　2.2 pH对凝胶化时间影响 56%GPS/2%CS体积比为0.4 的混合液，pH 6.5升至7.0，37 ℃下GT从120 s减少到90 s（图2）。当pH 7.2时因CS溶解度减小而产生沉淀析出。GT：凝胶化时间； GPS：甘油磷酸钠； CS：壳聚糖.

　　2.3 温度对凝胶化时间影响 不同配比56%GPS/2%CS混合液（pH 6.9）的凝胶化时间随不同温度而变化。温度升高，凝胶化时间均减少，在37 ℃时均有快速凝胶化的特性（GT 为75～130 s）。体积配比为0.2的56% GPS/2% CS混合液，常温时可持续保持液相，30 min内未出现凝胶化，当温度升高至37 ℃时，GT为130 s。故选定该配比的CS/GPS体系为载药实验，考察载药凝胶的缓释性能（表1）。表1 温度对壳聚糖/甘油磷酸钠（CS/GPS）体系

　　2.4 凝胶相变动力学曲线 CS/GPS体系（v56%GPS/v2%CS =0.4，pH6.9）的透光率随温度升高而变化的凝胶动力学过程（图3）显示，随着温度从20 ℃升高到30 ℃，CS/GPS体系的透光率缓慢降低，在37 ℃附近因凝胶化出现，透光率急剧降低，并出现拐点，40 ℃以后固化，透光率几乎为0。而2% CS溶液的透光率随着温度从20 ℃升高到45 ℃，未见变化。图3 壳聚糖/甘油磷酸钠(CS/GPS)溶液（v56%GPS/v2%CS =0.4，pH6.9）及2%壳聚糖(2%CS)透光率随温度变化曲线CS/GPS溶液（v56%GPS/v2%CS =0.4，pH6.9）及2%CS透光率随温度变化曲线

　　2.5 CS/GPS复合物红外光谱表征 凝胶化复合物的IR光谱不同于CS和GPS的IR谱图中Ch3在2 860～2 950cm-1 处的CH伸缩振动吸收峰有明显增强（图4），而GPS中典型的P=O伸缩振动吸收双峰925 cm-1和950 cm-1，在复合物位的IR谱图中位移至910 cm-1和970 cm-1出现。吸收峰的变化和位移说明GPS的磷酸根和CS的氨基存在偶极静电作用，以及羟基间的氢键作用，而不是简单的物理混合。

　　2.6 载药凝胶的体外药物释放 依诺沙星原药3 h累积释放度达到97.7%，载药凝胶12 h累积释放度为62%，实验结果表明CS/GPS凝胶体系对药物依诺沙星有明显的缓释作用(图5)。图5 载药凝胶与依诺沙星原药的累积释放曲线