应用组织芯片研究Claudin4在胃腺癌中的表达及临床意义

　　　　 作者：张真真 张声 郑珂 陈虹 王行富 陈余

【摘要】 　　目的 探讨紧密连接蛋白Claudin4的表达与胃腺癌侵袭转移及预后的相关性。 方法 应用组织芯片免疫组织化学染色方法检测胃腺癌不同区域(黏膜层非肿瘤性胃腺上皮，黏膜层胃癌组织，肿瘤中心区胃癌组织，侵袭前沿区胃癌组织及淋巴结转移灶胃癌组织)Claudin4的表达情况。 结果 黏膜层非肿瘤区发生肠上皮化生的胃腺上皮Claudin4高表达，而正常胃腺上皮低表达(P<0.001);在癌组织中，从黏膜层、肿瘤中心区、侵袭前沿区到淋巴结转移灶中胃癌组织Claudin4表达呈现先上升后下降的抛物线式表达的趋势，肿瘤中心区胃癌组织Claudin4表达最高，淋巴结转移灶胃癌组织Claudin4表达最弱(P<0.05)。对肿瘤中心区胃癌组织Claudin4表达的分析发现，Claudin4的表达与胃腺癌Lauren分型有关，肠型胃癌Claudin4的表达高于弥漫型胃癌(P<0.05)，而与胃腺癌的浸润程度呈负相关关系(P<0.05﹚。Claudin4在胃腺癌的表达与患者的术后生存率没有明显关系。 结论 Claudin4的表达与胃腺癌的侵袭转移有一定的关系，可能参与胃腺癌侵袭转移过程中上皮与间叶表型的转化。

【关键词】 连接蛋白类 胃肿瘤 芯片分析技术 免疫组织化学

　　胃癌是我国的常见病和多发病，每年胃癌新发病例及死亡率分别占全部恶性肿瘤的17%和20%以上，仅次于肺癌[1]。胃癌患者的预后与肿瘤的侵袭转移密切相关。胃癌侵袭转移的重要机制之一是细胞间接触抑制的丢失，细胞粘附性降低。细胞间的连接受连接复合体(包括紧密连接、粘附连接、桥粒等)调节， Claudins是构成紧密连接的骨架蛋白，参与维持细胞极性、屏障及信号传导功能。近年发现Claudins在各种上皮源性肿瘤中表达异常，可能参与肿瘤的发生发展，但Claudins表达与胃腺癌侵袭转移及预后间的关系尚未完全阐明。Claudin4是Claudins家族成员之一，是产气荚膜梭菌肠毒素﹙CPE﹚碳末端的受体，是肿瘤靶向治疗的研究热点。笔者应用组织芯片免疫组织化学染色，检测Claudin4在胃腺癌组织中的表达，探讨其与胃腺癌侵袭转移及预后的关系。

　　1 材料及方法

　　1.1 材料 2000-2006年福建医科大学附属第一医院胃癌手术切除、有完整随访资料的存档蜡块109例。男性79例，女性30例，年龄中位数61岁(23～84岁)。病理诊断按照2003年WHO肿瘤新分类诊断标准(消化系统分册)：其中高～中分化腺癌28例，低～未分化腺癌81例;浸润程度：黏膜层～肌层浸润63例，浆膜及浆膜外层浸润46例;淋巴结转移98例，无转移11例;TNM分期：Ⅱ期12例，Ⅲ期75例，Ⅳ期22例。均为死亡病例，随访时间1～76月，中位生存时间12月。

　　1.2 组织芯片制备 根据HE切片在供体组织蜡块上选取目标区域并标记：黏膜层癌旁胃黏膜(正常胃黏膜上皮66例，肠化生上皮43例)，黏膜层胃癌组织，肿瘤中心区胃癌组织(即黏膜层与侵袭前沿中间的胃癌组织)、侵袭前沿区胃癌组织(即肿瘤纵向侵袭胃壁最远处)及淋巴结转移灶胃癌组织[2];将相应组织由供体蜡块转移至受体蜡块的阵列孔中，每个孔芯的直径2 mm，每个蜡块含有31个点，其中一个为标志点。

　　1.3 免疫组织化学染色 免抗人Claudin4多克隆抗体(浓缩型，1∶400稀释，德国Thermo Scientific公司);二抗(羊抗兔试剂盒，SP法，美国Labvision公司)。操作步骤如下：组织芯片蜡块4 μm连续切片，60 ℃烤片14 h，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后水化，高压热修复(柠檬酸pH 6.0，2 min)，自然冷却，过氧化物酶阻断10 min，非免疫动物血清室温孵育10 min，一抗室温孵育3 h，二抗孵育10 min，DAB显色镜下控制，每个步骤之间PBS冲洗3次，每次2 min。苏木素复染。以PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.4 判读标准 Clauidn4染色定位于胃腺癌细胞及癌旁胃腺上皮细胞膜和胞质，根据阳性染色细胞着色的程度判别结果：“-”为阴性;“+”呈棕黄色颗粒状;“”呈棕褐色颗粒状(图1)。两位病理科医师在双盲的情况下进行判读，如果判读结果不一致，则重新评估直到达成一致为止。

　　1.5 统计学处理 运用SPSS 10.0软件进行统计学分析，用MannWhitney U检验对两样本半定量等级资料进行分析，选用KruskalWallis H检验对多个样本的半定量等级资料进行分析，采用KaplanMeier法进行单因素生存分析。

　　A：正常胃黏膜上皮;B：肠化胃黏膜上皮;C：胃腺癌与正常胃黏膜移行处;D：肿瘤中心癌组织;E：侵袭前沿癌组织;F：淋巴结转移灶.

　　图1 Claudin4在胃腺癌不同部位及癌旁胃黏膜呈异质性表达(SP法 ×400)

　　Fig 1 Claudin4 heterogeneous expression in different areas of gastric adenocarcinomas and adjacent noneoplastic gastric epithelium(SP ×400)

　　2 结 果

　　2.1 Claudin4在黏膜层非肿瘤性胃腺上皮的表达 发生肠上皮化生的胃腺上皮Claudin4的表达高于正常胃腺上皮的表达(表1)。

　　2.2 Claudin4在原发性胃癌侵袭转移过程中的表达 伴随肿瘤的侵袭进展，Claudin4在胃腺癌细胞的表达呈现先升高后降低的抛物线式的表达趋势，也即从黏膜层肿瘤中心侵袭前沿淋巴结转移灶，其表达水平先是升高表达，然后呈降低的趋势 (表2)。表1 Claudin4在黏膜层非肿瘤性胃腺上皮的表达

　　Tab 1 Claudin4 heterogenous expression in intestinal metaplasia and normal gastric epithelium分 组☆nClaudin4表达强度-+正常胃腺上皮6646(68.7)18(28.4)2(3.0)肠上皮化生的胃腺上皮433(9.1)12(27.3)28(63.6)合计109493030 表中Claudin4表达强度数据为n(%). 组间比较，☆：P<0.05.表2 Claudin4在原发性胃腺癌侵袭转移过程中的表达

　　2.3 肿瘤中心区Claudin4表达与胃腺癌临床病理学特征及预后关系

　　2.3.1 肿瘤中心区胃腺癌组织Claudin4表达与Lauren分型的关系 肿瘤中心区胃腺癌组织Claudin4表达与Lauren分型有关，肠型胃癌Claudin4的表达高于弥漫型胃癌(表3)。

　　2.3.2 肿瘤中心区胃腺癌组织Claudin4表达与临床病理学的关系 肿瘤中心区Claudin4表达与胃腺癌的浸润程度有关，肿瘤浸润局限于黏膜层肌层内的患者，其肿瘤中心区胃腺癌组织Claudin4的表3 肿瘤中心区胃腺癌组织Claudin4的表达与Lauren分型的关系

　　Tab 3 The relationship of claudin4 expression and Lauren classificationLauren分类☆nClaudin4表达强度-+肠型胃癌614(6.6)12(19.7)45(73.8)弥漫型胃癌486(12.5)16(33.3) 26(54.2)合计109102871 表中Claudin4表达强度数据为n(%). 组间比较，☆：P<0.05.

　　表达高于肿瘤浸润至浆膜层及浆膜外患者的肿瘤中心区胃癌组织的表达，未发现Claudin4的表达与患者性别、年龄、组织学分类、淋巴结转移及临床分期的关系(表4)。表4 肿瘤中心区Claudin4表达与临床病理学的关系

　　2.3.3 肿瘤中心区胃癌组织Claudin4表达与胃癌患者术后生存率的关系 肿瘤中心区胃腺癌Claudin4阴性表达者中位生存时间(13.5±2.96)月，“+”表达者中位生存时间(12.46±1.82)月，“”表达者中位生存时间(15.93±1.59)月，Log Rank检验P=0.481，提示肿瘤中心区Claudin4表达与胃癌患者术后生存率无关(图2)。

　　3 讨 论

　　Claudins家族是上皮细胞顶端紧密连接蛋白的一组跨膜蛋白，有20多个成员，分子量为17～27 kD，含有4个疏水跨膜区域和两个细胞外的环状结构，参与上皮上皮、上皮内皮之间的相互作用，包括维持细胞极性、屏障功能及细胞内外的物质交换、信号传递等。Claudins表达异常导致细胞极性紊乱和分离，可能是肿瘤发生发展的早期事件[3]。Claudin4在许多上皮性肿瘤中异质性表达，参与肿瘤细胞的凋亡、分化、浸润及转移，是肿瘤靶向治疗的潜在位点。

　　Cunningham等发现，Claudin4在异型增生的胃腺上皮中表达率远高于正常胃腺上皮，并提示Claudin4可作为胃黏膜癌前病变的预测指标[4]。笔者研究显示，Claudin4在肠上皮化生的胃腺上皮中高表达，而正常胃腺上皮不表达或弱表达;肿瘤中心区胃癌组织Claudin4的表达与Lauren分型有关，肠型胃癌Claudin4的染色强度明显高于弥漫型胃癌，后者预后不良。Ueda等发现，Claudin4在直肠癌的侵袭前沿及转移灶中表达降低，体外实验也发现， 反义RNA干扰Claudin4在SW480直肠癌细胞中的表达，癌细胞运动能力增强，提示Claudin4的低表达可能会促进肿瘤的侵袭与转移[5]。笔者的研究也发现，Claudin4与胃癌的浸润深度呈负相关，浸润局限于肌层内的胃腺癌组织高表达，而浸润至浆膜层及浆膜外者低表达;胃腺癌不同区域Claudin 4表达呈异质性，即黏膜层肿瘤中心区侵袭前沿淋巴结转移灶胃癌组织Claudin4表达呈抛物线的趋势，肿瘤中心区胃癌组织表达最高。提示Claudin4的表达对胃腺癌可能有双重作用：一方面Claudin4过表达，上皮细胞紧密连接的重建及细胞极性的丧失，从而促进肿瘤的发生发展[3];另一方面，Claudin4过表达可能会抑制肿瘤的侵袭与转移。Usami等认为，侵袭与转移是肿瘤细胞表型出现上皮间质转化(EMT)的结果，肿瘤中心的癌细胞呈现上皮表型，而侵袭前沿及淋巴结转移灶癌细胞出现间质细胞表型，肿瘤细胞的黏附性降低，侵袭能力增强[6]。 Claudin4在肿瘤组织中表达异常可能与Cdx2，Snail等转录因子的调节、DNA甲基化等有关[79]。本次研究入选胃癌患者80%为临床Ⅲ～Ⅳ期的患者，生存分析发现Claudin4在肿瘤中心的表达与术后生存率无明显相关性，提示Claudin4的表达不能作为晚期胃腺癌患者独立的预后指标，但Claudin4在评估早期胃腺癌患者的预后意义尚需进一步研究。

　　Claudin4表达异常在胃腺癌发生发展中的作用及调节机制需要更多的实验证实，笔者的研究结果提示，Claudin4的表达与胃腺癌的侵袭转移有一定的关系，可能参与胃腺癌侵袭转移过程中上皮间质转化过程。

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