慢性低氧左移5HT诱发大鼠肺内动脉环收缩反应的浓度依赖性曲线

　　　　　　 作者：朱壮丽， 林秀珍， 林默君

【摘要】 　　目的 探讨慢性低氧对大鼠肺内动脉血管重构以及5HT诱发肺内动脉血管环收缩效应的影响。 方法 常压慢性低氧诱导慢性肺动脉高压大鼠模型。比较正常组(NOR组)和慢性低氧组(CH组)大鼠血流动力学参数平均右心室收缩压(mRVSP)，平均右心室压(mRVP)及右心室压最大上升速率(dp/dtmax)及右心室肥厚指数以鉴定模型;光学显微镜下观察肺血管的病理改变;记录肺内动脉血管张力，观察5羟色胺(5HT)收缩效应;比较不同Ca2+通道阻断剂对5HT引起的收缩效应的阻断作用。 结果 与NOR组比较，低氧3～4周后CH组的mRVSP、mRVP、dp/dtmax和右心室肥厚指数均明显增高(P<0.01);CH组大鼠肺内动脉中膜显著增生;CH组的5HT引起的肺内动脉环收缩的浓度依赖性反应曲线左移;30 μmol/L氯化镧对30 μmol/L 5HT预收缩肺内动脉血管环效应的阻断作用在CH组显著增高(P<0.01)，但30 μmol/L SKF 96365的阻断作用无显著性意义。 结论 慢性低氧3～4周可稳定引起大鼠肺动脉高压，并左移5HT诱发的肺内动脉环收缩的浓度依赖性反应曲线;Ca2+池操纵性Ca2+通道功能的上调可能是CH组5HT高反应性的一种机制。

【关键词】 肺动脉 高血压 肺性 疾病模型 动物 慢性病 缺氧 血清素 血管收缩 血管舒张 钙通道

　　慢性低氧可引起肺血管持续性收缩，从而导致肺动脉高压，随之发生血管重构和右心室肥厚，最终引起右心衰竭和机体死亡[1]。低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension， HPH) 常继发于久居高原或胸、肺和心脏疾病，是临床常见的呼吸系统疾病，其中肺血管收缩和肺血管结构重建是其发病的基本病理过程。急性HPH多以肺血管收缩为主，而慢性HPH的形成是以肺血管重构为主[23]。内皮源性的影响因素以及许多体液因素可以造成血管收缩和舒张功能障碍，继而引起血管紧张度增加。5羟色胺(5Hydroxytryptamine，5HT)是一种强效的肺血管收缩剂和有丝分裂原，在慢性肺动脉高压患者体内其浓度明显增高[4]。本实验在慢性HPH大鼠模型上，观察慢性低氧对大鼠肺内动脉血管和右心室重构以及5HT对肺内动脉血管张力的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物 成年健康雄性SD大鼠[上海史莱克实验动物中心，SCXK(沪)20070005]，体质量230～280 g。

　　1.1.2 药品 5HT(114K7028)、SKF 96365(107K4613)、苯肾上腺素(phenylephrine hydrochloride，PHEN，114K7028)、乙酰胆碱(acetylcholine，036K0151)、氯化镧(Lanthanum chloride heptahydrate，La3+，066K0188)、硝苯地平(Nifedipine，72H0528)均为美国Sigma公司产品，其余均为市售国产分析纯。氧气浓度分析仪(ProOX110型，美国BioSpherix公司);O2浓度探头(E702型，美国BioSpherix公司);压力传感器管(YPJ01型，成都仪器厂);微机信号采集处理系统(RM6240型，成都仪器厂)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 慢性HPH大鼠模型制备 正常氧浓度组(NOR组)：雄性SD大鼠置于常压和正常氧浓度(21%)中饲养3～4周。慢性低氧组(CH组)：在常压的低氧室中饲养3～4周，低氧室以氮气和空气混合气维持氧气水平于(10±0.1)%(图1)，低氧室一进气口持续注入适量的空气(21%);将氧气浓度分析仪氧浓度调定点设定于(10±0.1)%，实时监测低氧室氧浓度，并反馈控制低氧室的另一进气口99.99% N2供应的频率和持续时间[5]。

　　1.2.2 血流动力学实验 大鼠腹腔注射1 000 U肝素钠0.5 mL肝素化。经20%乌拉坦(5 mL/kg)腹腔注射，大鼠麻醉后仰位固定。取15 cm长的PE50导管，一端稍弯曲定型成一定弧度制备右心导管，另一端与压力传感器管相连，并通过微机信号采集处理系统实时监测压力曲线。分离右侧颈静脉，结扎右颈外静脉远心端，向近心端插入导管，并慢慢推进，根据显示的压力曲线波形判断导管尖端的位置，插入1～2 cm即可达上腔静脉，3～4 cm到图1 慢性低氧室氧浓度实时监测示意图

　曲线达右心房，再继续深入插管并监测波形，稍加旋转，当出现明显的楔记波形时，则表明插管进入右心室，记录并计算右心室平均收缩压(mean right ventricular systolic pressure，mRSVP)、右心室内压(right ventricular pressure，RVP)、右心室压最大上升速率(maximal rate of rise of right ventricular pressure，dp/dtmax)等。

　　1.2.3 肺组织苏木精伊红(HE)染色切片制作 取大鼠左侧肺叶，10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片。HE染色后，光镜下观察2组肺血管形态。

　　1.2.4 肺内动脉血管环张力检测 大鼠肝素化及麻醉后，开胸快速取下左上肺叶和右下肺叶，置于含4 ℃混合气体(95% O2+5% CO2)Kreb’s液(mmol/L:NaCl 118，KCl 4.7，CaCl2 2.5，MgSO4 1.2，Kh3PO4 1.2，NaHCO3 25，Glucose 11.1;pH 7.4)的培养皿内，体视显微镜下小心分离出肺内小动脉(直径1.0～1.5 mm)，去掉周围脂肪和结缔组织，剪成长宽约3 mm的血管环，小心去除内皮后，血管环置于持续通入混合气体、37 ℃恒温的、含Kreb’s液的浴槽(容积5 mL)中，并给以0.8～1.0 g负荷，经换能器(JZJ01)转换后在RM6240微机信号采集处理系统上描记张力变化。平衡2 h，每20 min换kreb’s液一次。实验前给予60 mmol/L KCl收缩血管，前后连续2次得到的收缩幅度差<10%被认为标本反应可重复，否则弃之。血管环以终浓度1 μmol/L PHEN预收缩达最大幅度后，10 μmol/L乙酰胆碱引起舒张反应<20%作为判断内皮去除完全的标准。每次给药后冲洗5 次，张力回复到正常水平30 min后，再进行下一步实验。待曲线回至基线并稳定3 min后用5HT(103～100 μmol/L)对血管环进行梯度收缩，直至血管最大收缩达到一个稳定的坪值即为5HT浓度累积反应曲线。

　　在3 μmol/L硝苯地平抑制电压依赖性钙离子通道的基础上，分别观察30 μmol/L La3+和30 μmol/L SKF 96365 对30 μmol/L 5HT预收缩效应的抑制作用。

　　实验中以60 mmol/L KCl 的收缩张力标化血管环对5HT的反应强度及两种阻断剂的效应，即：

　　收缩张力比率=5HT引起的收缩张力/60 mmol/L KCl引起的收缩张力×100%

　　描绘5HT的累积浓度收缩曲线，并计算出半数有效浓度(EC50)。各阻断药对收缩反应的抑制率用下式表示：

　　抑制率=收缩幅度用阻断药前-收缩幅度用阻断药后60 mmol/L KCl引起的收缩张力×100%

　　1.2.5 右心室肥厚检测 开胸取出心脏，分离右心室(R)和左心室(L)+室间隔(S)，滤纸吸干水分称质量。计算右心室肥厚指数和右心室体质量(body weight，BW)比值以反映右心室肥厚的程度：

　　右心室肥厚指数=RL+S=mRmL+mS×100%

　　右心室体质量比值=RBW=mRmBW×100%

　　1.3 统计学处理 所有数据以x±SD表示，组间比较用成组t检验。以SPSS 10.0软件进行数据的统计学分析，以SigmaPlot 8.0软件进行数据曲线拟合处理，绘制量效曲线及其他统计图形。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠右心室血流动力学和右心室肥厚程度比较 与NOR组比较，CH组大鼠的右心室血流动力学参数(mRVSP、mRVP和 dp/dt max)和右心室肥厚程度增加，差别有统计学意义(表1，2和图2，P<0.01)，提示在本实验条件下慢性低氧3～4周可成功诱导大鼠形成肺动脉高压。

　　2.2 肺内动脉形态观察 NOR组不同口径的大鼠肺内血管内皮细胞连续性较好，细胞分布均匀，管壁厚薄一致(图3A，C);而CH组不同口径大鼠肺内小动脉内皮细胞肿胀、变性、坏死和脱落(图3B，D);血管中膜平滑肌细胞明显增生，管壁呈不规则增厚、变形，管腔变小，肺内小动脉管壁厚度占管径的百分比及管壁面积占血管总面积的百分比明显增大，并伴有管壁炎性细胞浸润。提示慢性低氧3～4周可诱发大鼠肺内动脉发生重构。1 mmHg=133.3 Pa.表1 NOR组和CH组右心室血流动力学参数比较

　　2.3 正常和慢性低氧大鼠肺血管环对5HT的浓度收缩曲线比较 图4显示5HT诱发的肺内动脉血管环收缩反应的浓度依赖性(10-3～100 μmol/L)曲线，CH组较NOR组明显左移，在1 ～30 μmol/L具有显著性差异(P<0.01);100 μmol/L 5HT最大收缩张力比率值由NOR组的(105.24±25.03)%增加到CH组(171.60±45.98)%(P<0.05);EC50值分别由NOR组的4.00 μmol/L变化为CH组1.46 μmol/L，差别有显著性意义(P<0.01)。

　　2.4 不同阻断剂对30 μmol/L 5HT预收缩效应的阻断作用 60 mmol/L KCl引起的肺内动脉血管环张力在NOR组(0.20±0.03)g和CH组

　　A，C:正常组大鼠肺内动脉连续性较好，细胞分布均匀，管壁厚薄一致;B，D：慢性低氧组大鼠肺内动脉发生重构， 中膜平滑肌细胞明显增生.差别无统计学意义，提示高KCl通过开启电压依赖性Ca2+通道所引起的肺内动脉收缩反应在慢性低氧条件下无显著增强。

　　在3 μmol/L硝苯地平特异性阻断电压依赖性Ca2+通道的基础上，30 μmol/L La3+对30 μmol/L 5HT预收缩肺内动脉血管环的阻断作用，与NOR组(9.23±2.65)%比较，CH组(23.88±5.78)%显著增高(P<0.01);但30 μmol/L SKF96365对其阻断作用差别无统计学意义(图5)。3 讨 论

　　慢性低氧刺激可导致肺内动脉平滑肌细胞发生一系列形态学改变如肥厚、增生，以及功能改变，如细胞膜上离子通道密度的调整以及对各种血管活性物质反应性的改变。HPH主要的变化特征是低氧性肺血管收缩和肺血管结构重塑。急性低氧时，肺血管内皮细胞释放大量血管活性介质(如白三烯、细胞因子、血小板活化因子)，引起肺血管收NOR组：正常组;CH组：慢性低氧组.缩。慢性低氧一方面可造成血管内皮细胞损伤，血管舒缩平衡被打破，而血管舒张功能下降是造成肺循环阻力增大的主要原因，另外低氧增强血管对活性物质(如内皮素1，5HT等)的反应，呈现慢性痉挛和过度肌化状态，致使肺血管细胞外基质重构[6]，增加肺循环外周阻力;另一方面持续低氧使肺内多种生长因子及癌基因的表达增加，促使肺血管壁细胞增殖，管壁增厚，管腔狭窄，并最终出现肺动脉高压。右心室重构及肺内动脉重构和痉挛致使肺动脉高压加重[7]。

　　本研究所采用的造模系统性能稳定，利用比例调控模式，周期性注入氮气，即根据低氧室内的氧浓度实时调节氮气灌注的频率和流量。每个周期中氮气灌注频率以及每次灌注的氮气量随低氧室内氧浓度与调定点的距离的缩短而相应减小，一方面保证每次开关低氧室后其内氧浓度重调过程的平稳、快速、安全，有效降低动物死亡率;另一方面达到设定的调定点后氧浓度的波动基本控制在0.1%的范围内，有效降低了低氧室内氧浓度的波动，保障造模的稳定性和成功率。表现为：(1)模型大鼠右心室血流动力学参数和右心室肥厚指数的稳定增加，并具有显著性意义;(2)肺内动脉管壁增厚和管腔狭窄，中膜平滑肌细胞增生肥大，细胞外基质如胶原增多导致中膜肥厚。内膜和中膜的厚化能明显降低肺血管顺应性，从而出现明显肺动脉高压，且由于这些结构的改变在停止低氧后短时间内不能逆转而造成肺动脉高压持续存在[5]。

　　笔者通过对慢性低氧大鼠的肺内动脉血管环进行离体研究，比较NOR组与CH组5HT诱发的肺内动脉血管环收缩反应的浓度依赖性(10-3～100 μmol/L)曲线，结果表明慢性低氧可显著上调5HT引起的肺内动脉血管环的收缩反应。各种类型的肺动脉高压研究已经证实，肺动脉高压的发生伴随体循环5HT浓度升高，5HT高反应性，以及5HT的促有丝分裂作用[89]。慢性低氧时体循环5HT浓度升高，同时肺动脉对5HT的高反应性导致血管紧张度增加，呈现慢性痉挛和过度肌化状态;5HT可通过5HT转运体和5HT受体作用于肺动脉平滑肌细胞，分别导致肺动脉平滑肌细胞增殖和胞内钙离子浓度升高，而胞内钙离子浓度升高是肺血管收缩的基础，另一方面又可促进肺动脉平滑肌细胞增殖，肺血管细胞外基质重构，增加肺循环外周阻力，从而形成肺动脉高压，这是5HT参与的肺动脉高压的一个发病机制。

　　本研究进一步分析其可能的机制。笔者观察到慢性低氧肺内动脉血管环对KCl诱发的收缩反应无明显增强，表明慢性低氧主要不是通过膜去极化介导的电压依赖性Ca2+通道开放引起Ca2+内流增加和血管环收缩[10]。这种反应可能涉及某种非电压依赖性的钙离子通道[4，11]。笔者前期的研究发现，在慢性HPH大鼠模型中，经典瞬时感受器电位通道家族中TRPC1及TRPC6表达增强，同时特异性肌浆网Ca2+泵抑制剂thapsigargin激活的Ca2+池操纵性Ca2+通道，以及能直接透过胞膜的二酰甘油同类物激活的受体操纵性Ca2+通道所介导的Ca2+内流也增强，最终引起肺内动脉平滑肌细胞静息胞内游离Ca2+浓度增加，这种功能和表达的上调是慢性肺动脉高压发病时，肺内动脉平滑肌细胞静息游离Ca2+浓度升高和肺内动脉血管静息张力增加的分子基础[5]。

　　本实验在用硝苯地平预先抑制电压依赖性Ca2+通道的基础上，分别观察能特异性阻断Ca2+池操纵性Ca2+通道的30 μmol/L La3+和特异性阻断受体操纵性Ca2+通道的30 μmol/L SKF96365对5HT预收缩的阻断作用[5，7]。结果显示，La3+的阻断效应在CH组显著增强，而SKF96365的阻断作用在两组差别无统计学意义，提示慢性低氧后Ca2+池操纵性Ca2+通道功能上调参与介导肺内动脉对5HT的高反应性，而与电压依赖性Ca2+通道和受体操纵性Ca2+通道无显著相关性。

　　综上所述，慢性低氧3～4周可稳定引起大鼠肺动脉高压，并左移5HT诱发的肺内动脉环收缩的浓度依赖性反应曲线，Ca2+池操纵性Ca2+通道功能的上调可能是CH组5HT高反应性的一种机制。

参考文献

　　[1] Humbert M， Sitbon O， Simonneau G. Treatment of pulmonary arterial hypertension[J]. N Engl J Med， 2004，351(14):14251436.

　　[2] Mehran M，YuanCheng B，Fung W H，et al. Cellular and molecular mechanisms of pulmonary vascular remodeling：role in the development of pulmonary hypertension[J]. Microvasc Res， 2004，68(1)：75103.

　　[3] Marc H，Nicholas W M，Stephen L A，et al. Cellular and molecular pathobiology of pulmonary arterial hypertenmon[J]. J Am Cardiol， 2004，43(12)：13S24S.

　　[4] Rodat L， Savineau J P. Effect of chronic hypoxia on voltageindependent calcium influx activated by 5HT in rat intrapulmonary arteries[J]. Pflugers ArchEur J Physiol， 2007，454(1):4151.

　　[5] Lin M J，Leung G P，Zhang W M，et al. Chronic hypoxiainduced upregulation of store-operated and receptoroperated Ca2+ channels in pulmonary arterial smooth muscle cells: a novel mechanism of hypoxic pulmonary hypertension[J]. Circ Res， 2004，95(5):496505.

　　[6] Vieillard B A，Frisdal E，Eddahibi S，et al. Inhibition of matrix metalloproteinases by lung TIMP1 gene transfer or doxycycline aggravates pulmonary hypertension in rats[J]. Circ Res， 2000，87(5)：418425.

　　[7] Cohen H，Chahine C，Hui A，et al. Bosentan therapy for pulmonary arterial hypertension[J]. Am J Health Syst Pharm， 2004，61(11)：11071119.

　　[8] Kereveur A， Callebert J， Humbert M， et al. Drouet L High plasma serotonin levels in primary pulmonary hypertension. Effect of longterm epoprostenol (prostacyclin) therapy[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2000，20(10):22332239.

　　[9] Keegan A， Morecroft I， Smillie D， et al. Contribution of the 5HT(1B) receptor to hypoxiainduced pulmonary hypertension: converging evidence using 5HT(1B)receptor knockout mice and the 5HT(1B/1D)receptor antagonist GR127935[J]. Circ Res， 2001，89(12):12311239.

　　[10] Marcos E， Fadel E， Sanchez O， et al. Serotonininduced smooth muscle hyperplasia in various forms of human pulmonary hypertension[J]. Circ Res， 2004，94(5):12631270.

　　[11] Scott A， Barman， Shu Zhu， et al. Hypoxia modulates cyclic AMP activation of BKCa channels in rat pulmonary arterial smooth muscle[J]. Lung， 2005，183(2):353361.