浒苔绿藻精抗实验性肝癌作用及其机理研究

　　　　作者：林文庭 吴小南 朱萍萍 张智芳 陈洁

【摘要】 　　目的 探讨浒苔绿藻精抗实验性肝癌作用及其机理，为开发利用浒苔资源提供依据。 方法 通过接种肿瘤细胞(h32)建立小鼠实验性肝癌模型，给予不同剂量浒苔绿藻精进行干预，测定抑瘤率、脾脏指数和细胞因子白细胞介素2(IL2)、血管内皮生长因子(VEGF)及转化生长因子β(TGFβ)以判断抑癌作用及作用机理。 结果 低、中、高剂量浒苔绿藻精均可抑制肿瘤生长(P<0.01)，抑瘤率分别为13.9%、30.3%和27.3%;各剂量浒苔绿藻精均可显著提高小鼠的脾脏指数(P<0.01);高剂量浒苔绿藻精可显著提高IL2水平(P<0.01);低、中、高剂量浒苔绿藻精均可显著降低TGFβ和VEGF水平(P<0.01)。 结论 浒苔绿藻精对实验性肝癌模型小鼠的肿瘤生长具有抑制作用，其抑制机理可能与其影响机体IL2、TGFβ和VEGF的水平有关。

【关键词】 肝肿瘤 实验性 藻类 绿 白细胞介素 2 转化生长因子 β 血管内皮生长因子

　　浒苔(Enteromorpha)是一种大型绿藻，为绿藻门石莼目石莼科浒苔属的藻类植物。我国海域特别是东海海域的浒苔资源十分丰富，仅福建沿海每年产量达108 kg以上，但目前大部分处于自生自灭状态，对环境和水产养殖的负面影响较大[1]。浒苔自古即为食用和药用藻类，是一种高蛋白、高膳食纤维、低脂肪的食品，同时，还具有较高的药用价值。研究认为，浒苔提取物具有抑菌活性、抗单纯疱疹病毒和辛德毕斯病毒活性、提高免疫力、抑制Ehrlich氏腹水癌和皮肤癌等作用[24]。绿藻中含有丰富的蛋白多糖复合物，通常称为绿藻精(chlorella growth factor，CGF)，也称为免疫增强剂，浒苔中也含有丰富的蛋白多糖复合物(CGF)。笔者以浒苔CGF为原料，研究其抗实验性肝癌作用及机理，为开发、应用浒苔深加工产品提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 浒苔CGF(福清市海兴保健食品有限公司)：蛋白质含量为29.9%，可溶性多糖含量为55.0%。清洁级昆明种小鼠，合格证号为SCXK(沪)20030003，中科院上海实验动物中心。基础饲料：参照GB14924.32001(小鼠配合饲料标准)配制。IL2、VEGF、TGFβ Elisa试剂盒(美国ADL公司);小鼠肝癌h32细胞(北京市肿瘤医院);RPMI1640培养基(Hyclone厦门鹭隆生物)。

　　1.2 仪器与设备 真空干燥箱(DZF6020型，上海精宏实验设备有限公司);Anke离心机(TDL5A型，上海市离心机械研究所);精密pH计(PHS3B型，上海楚柏实验室设备有限公司);电子天平(PL602S型)、旋转蒸发仪(RE52A型)及恒温水浴锅(DK80型)均为上海精宏实验设备有限公司仪器;Thermo Labsystems MK3酶标仪(芬兰雷勃);光照培养箱(150C，苏州威尔实验用品有限公司)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 动物分组 小鼠60只，雄性，6～8周龄，体质量18～22 g。随机分为6组：空白(对照)组、荷瘤模型组、氟尿嘧啶(5FU)组、浒苔CGF低、中、高剂量组，每组10只。小鼠置于塑料笼喂养，每笼5只，自由饮水和摄食。动物房室温20～25 ℃，相对湿度60%～80%。

　　1.3.2 建立h32肝癌皮下移植瘤模型 小鼠肝癌h32细胞经昆明种小鼠腹腔传代。无菌抽取腹腔内接种h32细胞的昆明种小鼠乳白色腹水，显微镜下细胞计数，台盼蓝染色检测肿瘤细胞存活率>95%。RPMI 1640培养基调整细胞密度为5×107 mL-1。经常规消毒后，荷瘤模型组、5FU组及浒苔CGF低、中、高剂量组均于右侧腋窝皮下注射0.2 mL的肝癌h32 细胞液，空白组注射等量生理盐水。

　　1.3.3 干预方法 从接种h32细胞后第3天开始，空白组和荷瘤模型组以生理盐水灌胃，5FU组以20 mg/kg的5FU溶液灌胃，浒苔CGF低、中、高剂量组分别以200、400和800 mg/kg的浒苔CGF水溶液灌胃，灌胃量均为每10 g体质量0.1 mL，每天1次，连续10 d。各组均喂食基础饲料，自由摄食饮水，每日观察小鼠一般情况，测量小鼠体质量。

　　1.4 标本采集 灌胃第10天晚上，禁食不禁水12 h，称体质量后摘眼球取血，小鼠脱颈椎处死，剥离瘤块并取脾。

　　1.5 观察指标及测定

　　1.5.1 小鼠体质量、瘤质量、抑瘤率 连续用药10 d后，称取小鼠体质量，处死后完整剥离肿瘤，用电子天平称取瘤质量;在无菌条件下，剪开皮肤和腹壁，取脾脏，称质量。抑瘤率和脾脏指数分别按下式计算：

　　抑瘤率(%)=(模型组平均瘤质量-实验组平均瘤质量)×100%/模型组平均瘤质量

　　脾脏指数(%)=脾质量/体质量×100%

　　1.5.2 细胞因子 IL2、VEGF和TGFβ采用双抗体夹心ELISA法测定，检定方法按照试剂盒说明书进行。

　　1.6 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件对数据进行统计学处理。资料先经正态分布和方差齐性检验，方差齐采用单因素方差分析(OneWay ANOVA)，组间差异两两比较采用LSDt检验法。

　　2 结 果

　　实验过程中，接种肿瘤的小鼠食欲渐减，体质消瘦，肿瘤处毛发失去光泽，有部分破溃，活动量逐渐减少，其中有部分小鼠失明。

　　2.1 浒苔CGF对h32肝癌小鼠的肿瘤生长和脾脏指数的影响 荷瘤模型组小鼠的体质量增长低于空白组而高于5FU组及浒苔CGF低、中剂量组， 5FU组小鼠的体质量增长均低于浒苔CGF各剂量组(均为P<0.01);浒苔CGF各剂量组和5FU组小鼠的瘤质量均明显低于荷瘤模型组(P<0.01)，抑瘤率分别为13.9%、30.3%、27.3%和21.2%;浒苔CGF各剂量组均可提高实验小鼠的脾脏指数(P<0.01)，而5FU组则降低脾脏指数(P<0.01，表1)。

　　2.2 浒苔CGF对h32肝癌小鼠IL2、TGFβ及VEGF的影响 荷瘤模型组的IL2水平明显低于空白组(P<0.01)，TGFβ和VEGF水平明显高于荷瘤模型组(P<0.01)。5FU组的IL2、TGFβ和VEGF水平明显低于荷瘤模型组(P<0.01)。高剂量CGF可提高IL2水平(P<0.01)，低、中、高剂量CGF可降低TGFβ和VEGF水平(P<0.01，表2)。表1 各组小鼠的肿瘤生长和脾脏指数表2 浒苔绿藻精对h32肝癌小鼠IL2、TGFβ及VEGF的的影响

　　3 讨 论

　　CGF为蛋白多糖复合物，包括多糖、蛋白质、氨基多糖、多肽、黏多糖及糖蛋白等多种分子形态。浒苔CGF蛋白质含量为29.9%，可溶性多糖含量为55.0%。本实验结果显示，浒苔CGF对荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用，其抑瘤效果甚至优于常规抗肿瘤药物5FU。以下对CGF抑瘤作用的可能机制进行简要分析。

　　3.1 提高IL2水平 IL2是一种由T细胞释放的细胞因子，是激活细胞毒性T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和B淋巴细胞的重要因素，在抗肿瘤免疫调节中起重要作用[5]。有研究表明，在恶性肿瘤患者体内，内源性IL2的产生能力以及肿瘤细胞对IL2的反应能力均显著降低，可导致恶性肿瘤进一步恶化、浸润和转移，IL2降低是抗肿瘤免疫缺陷的标志之一[6]。王江滨等认为肿瘤患者IL2等细胞因子水平下降，可能与肿瘤组织或抑制性T细胞、巨噬细胞释放抑制因子有关[7]。本试验荷瘤模型组的IL2水平明显低于空白组，而浒苔CGF干预可提高IL2水平，提示浒苔CGF对肿瘤生长的抑制作用可能与其提高IL2的水平有关。

　　3.2 降低VEGF水平 VEGF是目前所知的作用最强的促血管生长因子，在肿瘤血管生成过程中发挥核心作用[89]。研究发现实体瘤的生长具有血管倚赖性，VEGF在肿瘤的发生、发展、浸润和转移中发挥重要作用[10]，通过抑制VEGF表达而抑制肿瘤血管生成即可阻断肿瘤的生长，对肿瘤的治疗具有重要意义[11]。本试验荷瘤模型组小鼠血清中的VEGF水平显著高于正常对照组，浒苔CGF干预组的VEGF水平明显低于肿瘤模型组，说明浒苔CGF对肿瘤生长起抑制作用可能与其降低血管内皮生长因子水平有关。

　　3.3 降低TGFβ水平 TGFβ作为最主要的免疫抑制分子，与其信号转导元件一起在肿瘤免疫抑制的产生及肿瘤的形成、发展中发挥着重要作用[1213]。在肿瘤发生中，TGFβ1起双向调节作用，在肿瘤形成早期能抑制肿瘤形成，而在肿瘤发展过程中则起促进作用[14]。TGFβ1通过抑制IL2受体、细胞周期调节蛋白Rb、Cmyc等的表达以及诱导淋巴细胞调亡等生物效应，抑制T细胞的增殖、分化;TGFβ1可抑制CD4+细胞分泌细胞因子(如IL1、IL2、IL3、IL4等)抑制机体免疫应答;TGFβ1可下调CTL、NK和LAK细胞对于瘤细胞的杀伤物质[12]。同时，TGFβ1能够刺激肿瘤内血管形成，可能是通过刺激VEGF基因表达而促进肿瘤内部的新生血管形成，所以阻断TGFβ1，可以减少新生血管的形成[1415]。本试验荷瘤模型组小鼠血清中的TGFβ水平显著高于正常对照组;浒苔CGF干预组的TGFβ的水平明显低于肿瘤模型组。推测浒苔CGF对肿瘤生长起抑制作用，可能与其降低转化生长因子水平有关。

　　浒苔CGF对荷瘤小鼠肿瘤生长具有明显的抑制作用，其抗肿瘤作用的机制可能与其降低荷瘤小鼠的VEGF、TGFβ水平，提高荷瘤小鼠的IL2水平有关，而此3种细胞因子的相互关系则有待于进一步研究。

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