蛋白激酶Cα在兔自体移植静脉中的表达

　　　　　　 作者：蔡方刚， 吴捷， 詹腾辉， 郭平凡

【摘要】 目的 观察蛋白激酶Cα(PKCα)在兔自体静脉移植中的动态表达，探讨其与移植血管内膜增生的关系。 方法 采用兔自体颈静脉移植模型，25只新西兰大白兔随机分为5组，其中手术Ⅰ～Ⅳ组分别于术后3，7，14，28 d取材，假手术组(SO组)作为对照组。应用RealTime PCR法、Western Blot法分别检测各组中PKCα mRNA及其蛋白的表达变化；应用免疫组织化学法检测各组平滑肌细胞中PKCα的表达。 结果 与对照组比较，PKCα mRNA及其蛋白在术后3 d时，表达均明显升高（P<0.01），而后逐渐降至正常。免疫组织化学检测PKCα结果与Western蛋白印迹法一致。 结论 PKCα可能参与了自体静脉移植后的血管平滑肌增生过程中的信号转导。

【关键词】 肌，平滑，血管；静脉；移植，自体；蛋白激酶C；基因表达；疾病模型，动物

在动脉硬化性疾病治疗中，常用自体静脉作为移植桥的材料，但常因移植后的静脉狭窄而导致手术失败。许多研究表明，自体静脉移植后的再狭窄与血管的平滑肌细胞的增生有关，且该过程涉及到多种胞内信号转导途径[12]。蛋白激酶Cα(PKCα)与多种细胞的增殖、分化有关，但是否参与移植静脉的平滑肌增殖尚不明了。本实验通过检测移植静脉内的PKCα的动态变化，观察其与移植静脉再狭窄的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 雄性新西兰大白兔25只，体质量（2.75±0.25）kg（2.5～3.0 kg），由上海医学实验动物研究中心提供（证号：SCXK沪20020012）。随机均分为5组：（1）假手术组（SO组）：手术方法同其他组，但未行静脉移植；（2）手术Ⅰ组：于移植术后第3天取材；（3）手术Ⅱ组：于移植术后第7天取材；（4）手术Ⅲ组：于移植术后第14天取材；（5）手术Ⅳ组：于移植术后第28天取材。

　　1.2 方法

　　1.2.1 建立模型 3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉（30～35 mg/kg），剪毛，消毒，固定于手术台并铺巾。取颈正中切口，游离出右侧颈外静脉及左颈总动脉，在颈总动脉的上、下两端用无创动脉夹阻断血流后，横断血管，取右侧颈外静脉约2.0 cm置于对侧颈总动脉两断端之间，以90缝线采用间断外翻法行端端吻合，每个吻合口缝12针。检查无出血及吻合口漏血后即缝合伤口。麻醉时及术毕腹腔各注射青霉素8×105 U，术后皮下注射肝素6 250 U。

　　1.2.2 收集血管标本 手术组分别于移植后第3，7，14，21天行动物麻醉后，打开原切口，切取搏动良好的移植桥，对照组直接切取颈静脉。标本一部分用中性福尔马林固定，备行HE染色与免疫组织化学检查，一部分置于液氮内，备行PCR与Western Blot检测。

　　1.2.3 形态学检查 血管标本中性福尔马林固定后，切片行HE染色，行光镜检查。

　　1.2.4 RealTime PCR检测PKCα mRNA表达 取冻存的标本按下列方法检测：(1)总RNA抽提：用Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司），按说明书介绍的方法，提取RNA，用分光光度计测D260/D280值。（2）cDNA的制备：采用Promega公司的反转录试剂盒按说明书合成cDNA。（3）引物序列：设置βactin为内参照，根据Genebank设计引物。

　　PKCα：

　　上游：5’CCAGCATCTCATACAGCAGGAC3’

　　下游：5’AGTTCAAGGAGCCACAAGCAGT3’

　　βactin：

　　上游：5’GGGCCGGACTCGTCATACT3’

　　下游：5’CCTGGCACCCAGCACAAT3’

　　引物由美国Invitrogen公司合成。（4）RealTime PCR扩增：反应在TP800荧光定量PCR仪（日本TaKaRa公司）上进行。体系为cDNA 2.0 μL，PKCα、βactin特异上下游引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL（日本TaKaRa公司），去离子水补至25 μL。PCR循环条件为：95 ℃ 2 min→94 ℃ 10 s→60 ℃ 30 s，40个循环后进行熔解曲线的测定。（5）RealTime PCR的数据处理：数据分析按照文献[3]提供的方法进行：

　　目的基因的量=2-ΔΔCt

　　ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct内参基因）实验组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组

　　2-ΔΔCt表示实验组中的目的基因表达相对于对照组的变化倍数。

　　1.2.5 PKCα蛋白的检测 血管组织研磨成粉末，加入新鲜配置组织裂解液充分裂解后，置100 ℃水浴中加热，离心取上清，-20 ℃保存备用。用BCA蛋白定量试剂盒（PIERCE公司）测定蛋白浓度。取60 μg的蛋白样品，加入等体积的2×SDS上样缓冲液混匀，置100 ℃水浴中加热，离心取上清，于10％ SDSPAGE胶中电泳分离。电泳转移印迹至硝酸纤维素NC膜上，于室温下用封闭液（5%脱脂奶粉，0.1％ Tween20溶解于PBS中）封闭。加入用封闭液稀释的一抗（1∶500），4 ℃反应过夜；加入相应的HRP标记的二抗，室温下反应，暗室中压X光片，置自动洗片机中显影定影。

　　1.2.6 SP免疫组织化学染色法检测PKCα蛋白 切片常规脱蜡，3% h3O2作用10 min，置于枸橼酸工作液中行微波修复。按说明书所示方法行SP法免疫组织化学染色，一抗1∶500（美国Santa cruz公司），试剂盒购自北京中杉公司。阳性染色在细胞质和/或细胞膜呈棕黄色颗粒沉着。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件包进行统计学处理。数据比较采用t检验与方差分析，以P<0.05表示差别有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 移植后血管形态学观察 光镜下见正常静脉内膜被覆单层内皮细胞，中膜薄，由2～3层平滑肌细胞及少量结缔组织组成。移植后3 d可见内膜受损，有炎性细胞浸润，移植后1周可见明显内膜增生，随着时间的延长，在移植后的14，28 d渐见内膜增厚，有较多层的平滑肌细胞，血管管腔相对变小。

　　2.2 PKCα mRNA表达 在移植后的第3天，mRNA的相对表达量明显升高，约为对照组的（2.335±0.059）倍，2组间差别有统计学意义（P<0.01）。随着时间的延长，其表达量渐减少（图1）。

　　2.3 PKCα蛋白表达

　　2.3.1 Western Blot检测 PKCα表达在移植后第3天时明显增高，而后渐下降（图2）。

　　2.3.2 免疫组织化学检测 表达阳性细胞大部分位于增厚的中膜和内膜，增生组织中表达阳性细胞数明显高于非增生部分，且增生细胞胞质中棕黄颗粒也明显增多（图3）。　　SO为假手术组，Ⅰ～Ⅳ分别为术后第3，7，14，28天. 与SO组比较，☆：P<0.01.

3 讨 论

　　动脉硬化性闭塞症是一组多发于老年人的下肢动脉疾病，其治疗方法常采用血管旁路转流术，且多用自体静脉作为转流材料，但术后常发生移植静脉狭窄甚至阻塞而导致手术失败。有学者认为，这与移植静脉内血管平滑肌细胞（VSMC）增生有关，在VSMC增生过程中，细胞表型发生改变，细胞增殖、迁移并产生大量的细胞外基质，导致新生内膜的形成、管腔的狭窄[4]。VSMC的增生涉及到一系列的细胞信号转导过程，而PKC作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶，与细胞胞内的多种信号转导过程有关。

　　PKCα作为PKC传统型同工酶中的一种，存在于生物体的大多数血管组织内[5]。既往的研究发现，PKCα在人类大隐静脉细胞的增生过程中起着重要的作用[6]。研究还发现，PKCα可通过促进胞内的原癌基因sis及cfos等的表达、诱导cmyc基因表达使胞内DNA合成加快、激活MAPK途径等多种方式促进血管平滑肌细胞增生[710]。在本实验中，笔者应用兔的颈静脉移植模型，检测移植后静脉组织内的PKCα表达变化，结果显示，在静脉移植后的早期，PKCα mRNA及其蛋白表达升高，而后渐降至正常，其表达定位于增生的平滑肌细胞中。这表明PKCα可能参与了VSMC增生的初始过程的信号转导。

　　移植静脉内的PKCα增高可能与移植后的静脉内膜受到损伤而导致一系列的变化有关。研究表明，静脉移植后，因血流的压力变化可引起血管内膜上的内皮细胞的损伤，导致了血小板粘附与浸润。活化的血小板分泌许多炎症性细胞因子，如血小板源性生长因子（PDGF）、白介素1（IL1）、转化生长因子β（TGFβ）等[11]。局部的PDGF、TGFβ生成，可激活血管平滑肌细胞内的PKCα的生成[12]。

　　本实验发现，PKCα在术后早期的移植静脉内表达有显著升高，可能与血管平滑肌细胞的增殖初始过程有关。在细胞增殖的后期未见其表达升高，有可能与PKCα表达时点有关。以往的一项研究表明，当平滑肌细胞处于细胞周期的晚G1期时，PKCα表达升高甚至可能抑制其增殖[13]。移植血管的再狭窄是一个复杂的生物学过程，其中涉及到许多的信号转导通路，而PKCα在其中所起的作用还需进一步的实验予证实，以便为防治移植静脉的再狭窄寻找一种新的治疗方法。

参考文献

[1] Clowes A W，Reidy M A. Prevention of stenosis after reconstruction: pharmacologic control of intimal hypertension[J]. J Vasc Surg， 1991，13:885891.

[2] KIM S，IWAO H. Stress and vascular responses：mitogenactivated protein kinases and activator protein1 as promising therapeutic targets of vascular remodeling[J]. J Pharmacol Sci， 2003，91(3):177181.

[3] Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(Delta Delta C(T))[J]. Methods， 2001，25(4):402408.

[4] Mitra A K， Gangahar D M， Agrawal D K. Cellular， molecular and immunological mechanisms in the pathophysiology of vein graft intimal hyperplasia[J]. Immunol Cell Biol， 2006，84(2):115124.

[5] Cazaubon S M，Parker P J. Identification of the phosphorylated region responsible for the permissive activation of protein kinase C[J]. J Biol Chem， 1993，68(23):1755917563.

[6] Nishizuka Y. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C[J]. Science， 1992，258:607 614.

[7] Eude I，Dallot E，Ferre F， et al. Protein kinase C alpha is required for endothelin1induced proliferation of human myomet rial cells[J]. Biol Repord， 2002，66(1):4449.

[8] Hishikawa K，Nakaki T，Maruo T， et al. Pressure promotes DNA synthesis in rat cultured vascular smooth muscle cells[J]. J Clin Invest， 1994，93:19751980.

[9] Okazaki J，Mawatari K，Liu B， et al. The effect of protein kinase C and its alpha subtype on human vascular smooth muscle cell proliferation， migration and fibronectin production[J]. Surgery， 2000，128(2):192197.

[10] 胡新华，杨 军，刘程伟，等. JNK、p38 MAPK在移植静脉血管重塑过程中的表达研究[J]. 中华普通外科杂志， 2005，20(1):4548.

[11] Ishiwata S，Tukada T，Nakanishi S， et al. Postangioplasty restenosis: platelet activation and the coagulation fibrinolysis system as possible factors in the pathogenesis of restenosis[J]. Am Heart J， 1997，133:387392.

[12] Haller H，Quass P，Lindshau C， et al. Plateletderived growth factor and angiotensin Ⅱ induce different spatial distribution of protein kinase Ca and b in vascular smooth muscle cells[J]. Hypertension， 1994， 23:848852.

[13] Sasaguri T， Kosaka C， Hirata M， et al. Protein kinase Cmediated inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation: the isoforms that may mediate G1/S inhibition[J]. Exp Cell Res，1993 ，208(1):31120.