LHR真核表达载体构建及表达

【摘要】 目的 构建黄体生成素受体（LHR）真核表达质粒载体和建立稳定高表达LHR的乳腺癌细胞株。 方法 KpnⅠ/HpaⅠ双酶切LHRcDNA质粒载体获得目的基因，定向克隆构建pcDNA3.1(+)真核表达载体，酶切图谱和序列分析鉴定；重组质粒载体经脂质体转染MCF7乳腺癌细胞，G418筛选，RTPCR、细胞内cAMP测定，筛选鉴定高表达LHR MCF7细胞。 结果 重组质粒pcDNA3.1(+)LHR酶切图谱分析结果、序列分析证明pcDNA3.1(+)LHR载体中LHR序列与GenBank的LHR基因序列完全相符。RTPCR检测MCF7细胞LHR mRNA，MCF7细胞内cAMP浓度测定，证实MCF7细胞高表达LHR。 结论 构建并转染pcDNA3.1(+)LHR真核表达载体，在MCF7细胞中稳定表达，为探讨hCG对乳腺癌细胞的作用提供实验基础。

【关键词】 受体， LH； 绒毛膜促性腺激素； 乳腺肿瘤； 克隆细胞； 遗传载体； 基因表达RNA， 信使

人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin，hCG)是胚胎滋养层细胞分泌的一类具有重要生理功能的糖蛋白激素，通过与黄体生成素受体（luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor，LHR）结合发挥生物作用[1]。近年的研究发现乳腺细胞存在hCG受体，因此有学者认为妊娠期hCG对乳腺细胞的直接作用可能与生育后妇女乳腺癌发生率降低相关[24]。笔者通过建立高表达LHR的乳腺癌细胞株，探讨hCG对乳腺癌细胞的直接作用，以提供实验细胞模型。

1 材料与方法

　　1.1 材料 MCF7乳腺癌细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。含LHRcDNA的质粒载体由美国Louisville大学Zhenmin Lei教授提供。胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM培养基、G418、质粒载体pCDNA3.1(+)、pEGFP、脂质体转染试剂LipofectamineTM2000、RNA Trizol（美国Invitrogen公司）；限制性核酸内切酶ApaⅠ（美国Promega公司），限制性核酸内切酶KpnⅠ及NheⅠ（美国纽英轮生物技术有限公司）；1Kb DNA ladder Marker、小抽质粒抽提试剂盒（上海申能博彩生物科技有限公司）；大抽质粒抽提试剂盒Hispeed plasmid midi kit(25)（德国QIAGEN公司）；RTPCR试剂（日本TaKaRa公司）；cAMP EIA kit（美国Cayman公司）；hCG（美国Sigma公司）。引物合成与测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

　　1.2 方法 参照文献[56]。

　　1.2.1 构建pcDNA3.1(+)LHR重组质粒 KpnⅠ/HpaⅠ双酶切LHRcDNA质粒载体、KpnⅠ/EcoR V 双酶切pcDNA3.1(+)载体，琼脂糖电泳分离，胶回收纯化，T4DNA连接酶将pcDNA3.1(+)载体与LHRcDNA片段连接，构建的重组质粒命名为pcDNA3.1(+)LHR，具体操作步骤按说明书。按常规方法将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素（100 μg/mL）LB平板挑取单克隆，于2 mL LB培养扩菌，小量快速抽提试剂盒抽提载体质粒。应用酶切图谱分析方法鉴定，选取酶切图谱分析结果鉴定的2个克隆载体DNA送上海英骏生物技术有限公司进行DNA序列测定。pcDNA3.1(+)LHR质粒载体在含100 μg/mL氨苄青霉素的液体LB中大量培养，用Hispeed plasmid midi kit抽提质粒。

　　1.2.2 重组质粒转染MCF7细胞 将MCF7细胞按每孔2×105接种于24孔细胞培养板（美国corning公司），24 h后按每孔0.4 μg及1 μg分别将pcDNA3.1(+)LHR重组质粒及空载体质粒以LipofectamineTM2000转染入MCF7细胞，具体操作按试剂说明书。

　　1.2.3 筛选转染细胞 转染24 h后，加入400 μg/mL G418筛选转染细胞，每隔2 d换液，直至出现细胞克隆。用胰酶消化，在显微镜下挑取克隆，移至24孔板继续培养，G418筛选，并再次挑取单克隆细胞，大量培养。

　　1.2.4 鉴定转染细胞

　　1.2.4.1 RTPCR鉴定 根据已发表的LHR基因序列（NM 013582）设计并合成引物。引物序列：

　　F：5’ACAGCTGCTGGTGCTGGCAATG3’

　　R：5’TCCCTTGGAAAGCGTTCCCTG3’

　　RTPCR两步法扩增500 bp LHR目的片段，扩增条件如下：反应经94 ℃预变性5 min后进入循环；94 ℃变性45 s→57.5 ℃退火45 s→72 ℃延伸75 s，扩增32个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物，琼脂糖凝胶电泳，观察有无特异目的条带。

　　1.2.4.2 cAMP 浓度测定方法鉴定 将稳定转染LHR的MCF7细胞按每孔4×105接种于12孔细胞培养板，24 h后弃旧培养基，用无血清DMEM培养基洗2遍，每孔加入含0，0.16，1.6，16 IU/mL hCG的DMEM培养基0.4 mL， 置于体积分数为0.05的CO2、37 ℃培养箱培养2 h，收集上清液，按操作说明书测定。

2 结 果

　　2.1 重组质粒鉴定 重组质粒pcDNA3.1(+)LHR酶切图谱分析，琼脂糖电泳结果见图1。酶切图谱显示，酶切结果与pcDNA3.1(+)LHR 重组载体酶切位点相符。

　　2.2 测序结果 以质粒pcDNA3.1(+)的通用引物BGH、T7为测序引物，测定结果显示pcDNA3.1(+)LHR载体中LHR序列与LHR基因序列完全符合。

　　2.3 转染细胞的筛选、鉴定 重组质粒转染MCF7乳腺癌细胞后，经G418筛选，14 d后24孔板上见G418抗性的细胞克隆形成。经2次筛选后转染重组质粒的细胞挑出8个克隆，提取细胞RNA，经ND1000紫外分光光度测定RNA浓度，经RTPCR扩增，发现转染重组质粒后细胞表达LHR，转染空载体细胞不表达目的LHR（图2），选择第8克隆细胞进行实验。LHR属于G蛋白偶联受体超家族成员，对LH与hCG有高亲和性，cAMP作为第二信使，参与其信号转导。本实验通过检测hCG作用后转染LHR及空载体MCF7细胞内cAMP浓度（表1），证实转染LHR的MCF7细胞高表达LHR。

3 讨 论

　　hCG的主要生理功能是刺激卵巢黄体分泌孕酮，维持妊娠，促进乳腺发育。近年来的研究发现hCG具有抑制乳腺癌发生、发展的作用，针对hCG的表1 hCG对乳腺癌细胞cAMP浓度影响

　　研究可望能为乳腺癌的防治提供新的思路[79]。hCG在体内的重要生理功能是由LHR介导。但由于LHR在乳腺细胞表达较低，体外hCG对乳腺癌细胞的作用不明显，影响作用机制的深入研究，因此本实验通过建立稳定高表达LHR的乳腺癌细胞株，为探讨hCG对乳腺癌细胞的作用机制提供体外研究的细胞模型。

　　笔者成功构建了pcDNA3.1(+)LHR真核表达载体，经LipofectamineTM2000转染，G418筛选，获得高表达LHR的MCF7细胞克隆。LHR在hCG刺激后，激活膜内腺苷酸环化酶，促进ATP转化为cAMP，cAMP进一步激活PKA，cAMP是LHR信号转导途径重要的信息传递分子[5]。hCG作用于稳定表达LHR的MCF7细胞，其cAMP水平明显升高，证实转染后MCF7细胞表达LHR，成功构建高表达LHR的MCF7细胞。这一工作的完成，为进一步研究hCG对乳腺癌的作用及其作用机制提供前提条件。

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