【摘要】 目的 探讨白藜芦醇(Res)对动脉粥样硬化兔心肌组织线粒体途径凋亡的影响。 方法 健康雄性新西兰白兔70只，随机分为5组：正常组、病理对照组、病理+低剂量Res组(4 mg·kg-1·d-1)，病理+中剂量Res组(8 mg·kg-1·d-1)、病理+高剂量Res组(16 mg·kg-1·d-1)。分笼饲养12周后，取左心室尖部心肌组织。H-E染色观察心肌组织形态学改变，原位末端标记法检测心尖部细胞凋亡率，半定量RT-PCR检测bax、bcl-2的mRNA变化。 结果 H-E染色下各组细胞形态学改变不明显;病理对照组细胞凋亡指数高于正常组(P<0.01)和Res干预组(P<0.01)，Res作用下凋亡指数下降呈剂量依赖性(P<0.05);病理对照组bax、bcl-2 mRNA表达量较正常组升高(P<0.01)，而加入Res干预后，bax的表达量明显下降，bcl-2表达升高(P<0.01)。 结论 Res可以减少促凋亡基因bax的表达，增加抗凋亡基因bcl-2的表达，降低Bax/bcl-2比值，抑制心肌细胞的凋亡。
【关键词】 藜芦生物碱类; 动脉硬化; 基因，调节; 心血管药物(中药); 细胞凋亡; 心肌
许多细胞及动物实验研究表明，白藜芦醇(Resveratrol，Res)具有抗癌、抗血栓、抗过敏、抗氧化等药理作用[1]，是红葡萄酒中具有心血管保护作用的最重要的物质。笔者前期工作探讨了Res对血管内皮细胞的保护作用，以及改善动脉粥样硬化兔心肌纤维化的作用[2-3]。本研究将进一步探讨Res对动脉粥样硬化兔模型心肌细胞凋亡的影响，以及心肌细胞抗凋亡基因bcl-2、促凋亡基因bax表达情况。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 Res(上海纳贝生物科技股份有限公司，批号：RES20070401);吐温80(福建省医学科学研究所);TRIZOL试剂(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(美国Promega公司);Tap酶及dNTP(日本Takara公司);原位细胞凋亡检测试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。
1.1.2 主要仪器 石蜡切片机(RM2245型，美国Shandon公司);生物组织摊烤片机(JK-5型，武汉俊杰电子有限公司);组织匀浆机(T18 ULTRA-TURRA型，德国Polytron公司);核酸蛋白分析仪(DU640型，美国Beckman公司);PCR扩增仪(Mastercycler Personal型，德国Eppendorf公司);全自动凝胶成像分析系统(Imagemaster VDS-CL型，瑞典Amersher Pharmacia公司)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及处理 普通级8周龄健康雄性新西兰白兔70只(上海生旺实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK沪2002-0011)，饲养于福建省医学科学研究所动物实验室(许可证号：SYXK闽2006-0002)，体质量(2.0±0.2) kg。经普通饲料(苜蓿草粉)适应性喂养10 d后，随机分成5组，开始实验(实验第0周)：(1)正常组10只，喂普通饲料+生理盐水10 mL灌胃。(2)病理对照组18只，喂高脂饲料+0.5%吐温溶液10 mL灌胃。(3)病理+低剂量Res组14只，喂高脂饲料+Res 4 mg·kg-1·d-1稀释于0.5%吐温溶液10 mL灌胃。(4)病理+中剂量Res组14只，喂高脂饲料+Res 8 mg·kg-1·d-1稀释于0.5%吐温溶液10 mL灌胃。(5)病理+高剂量Res组14只，喂高脂饲料+Res 16 mg·kg-1·d-1稀释于0.5%吐温溶液10 mL灌胃。高脂饲料配方[4]：1%胆固醇+5%蛋黄粉+5%猪油+0.5%胆盐+88.5%普通饲料。每只兔限饲料100 g/d，自由饮水，实验第0周开始灌胃，每日1次，连续给药12周。上述Res剂量参照文献[5]。
1.2.2 组织切片观察 实验动物于第12周末称质量后予戊巴比妥钠麻醉，立即剖开胸腔，取兔心尖部心肌组织标本置于10%中性福尔马林溶液固定24 h，常规石蜡包埋、梯度脱水、透明、浸蜡、包埋，5 μm厚连续切片。
1.2.3 苏木素伊红(H-E)染色 二甲苯脱蜡蒸馏水冲洗3次，每次3 min，在苏木素溶液中浸泡10 min，用蒸馏水冲洗3次，每次3 min，取出后在1%盐酸酒精中分化，立即置入蒸馏水中冲洗;在伊红溶液中浸泡5 min，取出后用蒸馏水冲洗干净，经梯度酒精脱水、二甲苯透明1～2 min，共3次。中性树脂封片后显微镜观察。福建医科大学学报 2009年11月 第43卷第6期朱鹏立等：Res对动脉粥样硬化兔心肌组织凋亡的影响
1.2.4 原位末端标记检测心肌细胞凋亡 采用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的生物素平移末端标记技术(TUNEL法)标记凋亡心肌细胞，按试剂盒说明书操作。切片常规脱蜡脱水，微波抗原修复，新鲜配制3%h3O2，室温处理10 min，PBS冲洗3 min×2次，20 μg/mL蛋白酶K消化，PBS冲洗3 min×2次，滴加TUNEL混合液，于孵育盒中37 ℃ 60 min，PBS冲洗3 min×3次，每片加50 μL的碱性磷酸酶抗体，孵育盒中37 ℃ 30 min，PBS冲洗3 min×3次，每片2滴BCIP/NBT染色剂，室温下孵育30 min，PBS冲洗3 min×3次，水性封片剂封片，60 ℃烘干。光镜下观察正常细胞不被标记，细胞核蓝黑色的为阳性细胞。每张切片随机观察5~10个视野，计数每高倍镜视野(×400)中平均阳性凋亡细胞数，其阳性细胞数与总细胞的百分比为细胞凋亡指数反映各组心肌细胞凋亡的情况。
1.2.5 半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 称取心尖部心肌组织50～100 mg，Trizol法提取组织总RNA，按说明书操作。核酸检测仪下测定RNA的浓度和纯度，OD 260/280在1.8～2.0为符合要求。取RNA 1 μg于20 μL反应体系中逆转录mRNA为cDNA，目的基因及内参的引物序列、退火温度及产物长度见表1。各取PCR产物5 μL，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化已锭染色，应用Imagemaster VDS-CL对凝胶成像，以β-actin为内参照进行半定量分析。表1 半定量PCR的引物序列、退火温度及产物长度
1.3 统计学处理 数据以x±SD表示，使用SPSS 13.0进行统计分析。多个样本均数间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差别有统计学意义。
2 结 果
2.1 H-E染色 光镜下，正常组心肌组织条纹清晰，心肌纤维粗而长，螺旋状呈内纵、中环、外斜行排列整齐，心肌纤维之间可见较多的结缔组织，细胞核未见增大，染色均匀。病理对照组及病理+Res组心肌纤维稍紊乱，但未见明显的细胞核固缩、碎裂、溶解。
2.2 细胞凋亡率 光镜下，正常组偶见凋亡阳性细胞，病理对照组明显增多(P<0.01);而加入Res后，随剂量升高心肌凋亡细胞逐渐减少(P<0.05)，均少于病理对照组，但与正常组比较仍增多(P<0.01，表2，图1)。
2.3 心肌组织bax、bcl-2 mRNA表达情况 正常组bax、bcl-2 mRNA表达量与病理对照组比较均低表2 各组心肌组织细胞凋亡指数比较Res:白藜芦醇. 与病理对照组及病理+不同Res剂量组比较，△△：P<0.01;与正常组及病理+不同Res剂量组比较，▲▲：P<0.01;与病理+低剂量Res组比较，☆：P<0.05;与病理+中剂量Res组比较，★：P<0.05.
(P<0.01);与病理对照组比较，加入Res后bax的表达量明显降低(P<0.01)，bcl-2的表达量升高(P<0.01);在高剂量Res组，bax表达量比低剂量、中剂量Res组均明显降低(P<0.01)，而bcl-2的表达量则比低剂量组(P<0.01)和中剂量组(P<0.05)升高(表3，图2)。
Res:白藜芦醇. A：正常组，可见极少量的凋亡阳性细胞：B：病理组，可见细胞核呈蓝黑色的凋亡心肌细胞增多;C：病理+低剂量Res组，可见凋亡阳性细胞略有减少;D：病理+中剂量Res组，可见凋亡细胞略有减少;E：病理+高剂量Res组，可见凋亡细胞明显减少.表3 各组心肌组织中bax和bcl-2 mRNA表达量比较
Res:白藜芦醇. 与正常组、病理对照组+不同剂量组比较，▲▲：P<0.01;与病理对照组+低剂量Res组比较，☆☆：P<0.01，与病理对照组+Res中剂量Res组比较，△：P<0.05，△△：P<0.01.
A：bax PCR产物;B：bcl-2 PCR产物; Res:白藜芦醇. 1：正常组;2：病理组;3：病理+低剂量Res组;4：病理+中剂量Res组;5：病理+高剂量Res组.
3 讨 论
Res是一种多酚类化合物，广泛存在于花生、葡萄皮及中药虎杖、决明子、藜芦等72种植物中，是植物在恶劣环境或受到霉菌感染时产生的一种抗毒素，具有抗氧化、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗炎等生物活性，其中反式异构体比顺式异构体具有更强的心血管保护作用[6]。
在冠心病心肌严重缺血状态下，人类心肌细胞可表现为凋亡或坏死，但在急性心肌缺血的早期，心肌细胞的凋亡被认为是细胞死亡的主要形式[7]。在动脉粥样硬化病变中，有许多与细胞凋亡调节相关的基因，其中Bcl-2家族成员就是线粒体途径凋亡的重要调节因子，能够促进或抑制动脉粥样硬化血管壁细胞的凋亡。Bcl-2家族分成两类，一是抗凋亡基因，包括bcl-2、bcl-XL等;二是促凋亡基因，包括bax、bak、bcl-XS等。其中最常用的指标是bax/bcl-2和bcl-XS/bcl-XL，其比值增大，则细胞易于发生凋亡。bcl-2本身无促细胞增殖作用，而是维持细胞的幸存状态，对细胞起保护作用[8]。
Misao等通过免疫组织化学的方法发现，bcl-2在正常心肌和陈旧性心肌梗死的心肌中表达量极低;而在急性梗死时，bcl-2的表达仅限于梗死心肌周围被拯救的存活心肌，提示bcl-2可以提高心肌细胞对抗缺氧的能力[9]。Biondi-Zoccai等的研究显示，心肌梗死患者的心肌中，即使远离梗死病灶的非梗死区，也存在bax的高表达[10];bcl-2和bax之间形成一对正负调控因子，其比例决定细胞是否接受诱导凋亡的信号[11] 。除了心肌梗死外，在冠心病心力衰竭患者中，心肌细胞的凋亡也明显增多，bax表达量升高[12]。
在本实验中，给予高脂饲料喂养雄性新西兰白兔12周构建动脉粥样硬化兔模型后，TUNEL检测细胞凋亡率可见病理对照组细胞凋亡指数明显增高，与Orlandi等的研究结果相似[13]。但H-E染色下未见心肌组织细胞凋亡形态以及巨噬细胞浸润现象，考虑与所采用的试验方法敏感性比较低有关。当给予不同剂量的Res干预后，干预组心肌细胞的凋亡指数明显下降，且呈剂量依赖效应，提示Res具有减少动脉粥样硬化兔心肌细胞凋亡的作用。进一步测定bcl-2和bax mRNA水平的表达，发现在病理对照组两个基因的表达均升高，其中bax的升高提示促凋亡基因的启动，而bcl-2的升高则是细胞的一种自我保护反应，用以对抗缺氧、保护细胞生存状态[10]。随着Res剂量由低到高，bax的表达逐渐降低，bcl-2表达逐渐升高，bax/bcl-2比值升高，而且这种改变在高剂量Res组更加明显，说明Res对心肌细胞抑制凋亡的作用，可能是通过转录水平调节促凋亡基因bax和抗凋亡基因bcl-2的平衡来实现的。但是Res是通过何种途径对bcl-2和bax发挥调节作用、具体作用方式如何尚需进一步的研究。
本研究的初步结果揭示，Res可以促进抗凋亡基因bcl-2的表达，降低促凋亡基因bax的表达，提高心肌细胞在动脉粥样硬化状态下的生存能力，带来直接的心肌保护效应，从而为心血管疾病的治疗途径开辟了新的领域。
参考文献
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