选择性环氧合酶2抑制剂NS398下调K562/ADM细胞MDR1/Pgp表达

　　　　 作者：何火聪， 林根， 苏颖， 贾静， 邹长棪， 林华妹

【摘要】 　　目的 探讨选择性环氧合酶2（COX2）抑制剂NS398对白血病多药耐药K562/ADM细胞P糖蛋白（Pgp）表达的影响。 方法 以细胞K562/ADM为NS398作用的靶细胞，MTT法检测细胞增殖活性；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测多药耐药基因（MDRl）mRNA的表达；流式细胞仪（FCM）测定Pgp蛋白表达水平。 结果 NS398显著抑制K562/ADM细胞增殖，呈时间、剂量正相关效应；下调K562/ADM细胞MDRl基因表达并抑制Pgp合成，呈明显的剂量依赖关系。 结论 COX2抑制剂NS398可在一定时间和剂量范围抑制白血病多药耐药K562/ADM细胞MDRl/Pgp表达，并能抑制K562/ADM多药耐药细胞增值。

【关键词】 NS 398 K562/ADM细胞 P 糖蛋白 多药耐药

　　环氧合酶(cyclooxygenase，COX)是生物体内催化前列腺素合成的关键酶。已发现其亚型COX2与人类多种肿瘤具有密切联系，可能参与肿瘤的增殖、凋亡、肿瘤血管生成及肿瘤侵袭等，COX2已成为治疗和预防肿瘤的一个重要靶点[12]。近年来的研究显示，COX2可以上调多药耐药基因/P糖蛋白（MDR1/Pgp）的表达，而MDR1/Pgp的过度表达是肿瘤对放、化疗不敏感和导致治疗失败的一个重要原因[3]。因此，进一步明确COX2与MDR1/Pgp在白血病K562/ADM多药耐药细胞中表达的关系，对采用COX2抑制剂逆转或防止肿瘤耐药、增加放化疗敏感性具有重要理论和临床意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 COX2抑制剂NS398（美国Sigma公司）用DMSO配成100 mmol/L的贮存液，-20 ℃保存备用。阿霉素(ADM)（日本明治制药公司）。MTT、二甲基亚酚（DMSO）和RPMI 1640(美国AMERSCO公司)。Trizol(美国Invitrogen公司)。二步法RTPCR试剂盒(晶美生物工程有限公司)。MDR1和βactin引物（博亚生物工程有限公司）。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人Pgp抗体（BD Farmingen公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 靶细胞 K562/ADM细胞由福建省肿瘤医院放射生物研究室诱导保存。细胞接种于3.8 μg/mL ADM、20%新生小牛血清的RPMI 1640培养液中，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。实验时K562/ADM细胞一直培养在3.8 μg/mL ADM的细胞培养液中以刺激MDRl/Pgp高表达。

　　1.2.2 细胞增殖活性 K562/ADM细胞(每孔1×104)接种于96孔细胞培养板中，加入终浓度10～160 μmol/L的NS398，培养24，48，72 h后MTT法检测，计算细胞增殖抑制率。

　　1.2.3 MDR1基因mRNA表达 Trizol法提取经不同浓度NS398作用后的细胞K562/ADM细胞总RNA，以βactin为内参照，二步法RTPCR检测MDRl基因mRNA表达情况。

　　引物MDRl（167 bp）：
　　
　　上游：5'CCCATCATTGCAATAGCAGG3'
　　
　　下游：5'GTTCAAACTTCTGCTCCTGA3'

　　βactin（612 bp）：
　　
　　上游：5'GGCATCGTGATGGACTCCG3'
　　
　　下游5' GCTGGAAGGTGGACAGCGA3 '
　　
　　PCR产物扩增后进行凝胶电泳，凝胶图像分析系统(Geldoc XR，美国BIORAD公司)分析。

　　1.2.4 Pgp表达测定 K562/ADM细胞经不同浓度NS398作用后，收集细胞，PBS洗涤，分别加入FITC标记的抗人Pgp抗体，流式细胞仪检测Pgp的表达阳性率。

　　1.3 统计学处理 结果以x±s表示，SPSS 8.0软件进行相关统计分析。

　　2 结果

　　2.1 NS398对K562/ADM细胞生长的影响 NS398对K562/ADM细胞的增殖有明显抑制作用，且呈时间、剂量效应关系 (图1）。160 μmol/L作用72 h的抑制率为62.9%。表明COX2抑制剂NS398可明显抑制K562/ADM耐药细胞的增殖。

　　图1 NS398作用后对K562/ADM细胞的增值抑制（略）

　　Fig 1 NS398 inhibited the proliferation of K562/ADM cells

　　2.2 NS398对MDRl基因表达的影响 NS398可显著抑制K562/ADM细胞MDR1的表达，并呈时间和浓度依赖关系（图2）。在相同的作用时间内，随着NS398作用浓度的增加MDRl表达明显下降；而且在相同的作用浓度下，随着NS398作用时间的延长MDRl表达也明显下降。凝胶图像分析结果表明，160 μmol/L的NS398作用72 h后MDR1的表达强度比10 μmol/L的NS398作用24 h后MDR1的表达强度降低约2/3。

　　M：marker；10，20，40，80，160 μmol/L的NS398作用：24 h后（1～5），48 h后（6～10），72 h后（11～15）.

　　图2 相同浓度不同时间NS398作用后K562/ADM细胞的MDR1（167 bp）mRNA表达（略）

　　Fig 2 The expression of MDRl mRNA was detected with RTPCR

　　2.3 NS398对Pgp蛋白表达的影响 NS398可显著抑制K562/ADM细胞Pgp的表达，并呈时间和浓度依赖性，差别有统计学意义(P<0.05，图3)，结果与MDR1基因mRNA表达基本一致。160 μmol/L的NS398作用72 h后，Pgp合成显著降低，Pgp表达阳性率由83.59%（图3阳性对照）下降为36.43%。说明NS398通过下调MDRl/Pgp表达从而抑制K562/ADM多药耐药细胞增值。

　　3 讨论
　　
　　目前普遍认为，Pgp过表达是肿瘤 (白血病)多药耐药的最主要因素[4]。Pgp的主要功能是从细胞内逆浓度梯度排出一系列的疏水性抗癌药物，降低细胞内药物浓度至亚致死性水平，从而无法构成对肿瘤(白血病)细胞的有效杀伤而引起耐药。在肿瘤(白血病)多药耐药中，Pgp除作为“药泵”从细胞内主动性向外“泵”药、保护细胞免受抗癌药物的杀伤外，还可从Pgp+耐药细胞向Pgp-敏感细胞转移而使后者获得耐药性[5]。
　　
　　研究显示:COX2抑制剂可抑制多种肿瘤细胞的生长，与一些抗肿瘤药物合用具有协同作用[6]。因此，推测COX2及其抑制剂可能具有调节肿瘤MDR的作用。韩正祥等通过免疫组织化学染色法，检测32例乳腺癌组织中COX2蛋白与Pgp蛋白的表达情况。发现乳腺癌组织中COX2与Pgp表达呈正相关性，COX2可干预Pgp的表达并参与乳腺癌多药耐药(MDR)的调节[7]。林根等用免疫细胞化学染色法检测胃癌细胞株SGC7901 Pgp表达，发现NS398可抑制SGC7901的MDRl/Pgp表达，且呈剂量效应关系[8]。

　　
　　本研究在含有3.8 μg/mL ADM的体系中进行，以NS398作为干预因素，在K562/ADM中分别从转录及翻译水平观察NS398抑制K562/ADM的MDR1/Pgp表达。结果显示，在NS398抑制细胞增值过程中，无论是RTPCR检测MDRl mRNA的表达，还是流式细胞术检测K562/ADM细胞Pgp的表达，NS39与MDR1/Pgp之间都存在一定的剂量和时间上的依赖关系，表现为在一定范围的实验浓度及时间内，随着NS398浓度的增高及作用时间的延长，MDR1/Pgp表达量递减，MDRl mRNA表达水平降低约2/3；Pgp表达阳性率由83.59%下降为36.43%，提示NS398对白血病多药耐药K562/ADM细胞MDR1/PgP的表达具有抑制作用。推测NS398可能是通过抑制COX2活性，抑制COX2下游产物表达，从而影响MDR1/Pgp表达。COX2及其抑制剂对细胞增殖影响的作用途径之一可能是通过调节Pgp表达实现，这有待进一步证实。
　　
　　放、化疗可诱导肿瘤细胞高表达Pgp，许多相关研究表明，过度表达或激活COX2的肿瘤细胞对放、化疗具有抗拒作用，提示COX2在肿瘤耐药机PR：阳性率制上可能扮演了重要的角色，COX2抑制剂与化疗药联合运用有协同增敏作用[9]。但从目前已有证据看，推测COX2抑制剂与放、化疗联用的协同增敏作用，其机制可能是通过调节Pgp表达来实现也可能是通过抑制Pgp的药物泵出作用，增加化疗药物在细胞内的累积，从而减少化疗药物的耐药性[10]。一些临床试验的初步结果表明，选择性COX2抑制剂与化疗结合应用有一定的应用前景[1112]。

　　图3 NS398作用后K562/ADM细胞Pgp蛋白的表达（略）

　　Fig 3 The Pglycoprotein(Pgp) expression was measured using flow cytometry

　　目前，虽然有一些化学物质如钙离子通道拮抗剂、环抱素及其衍生物等也能抑制Pgp的合成，从而逆转多药耐药。但其中多数药物都存在不同缺陷，大多数药物在达到有效血药浓度时即可产生致命的不良反应。故理想的Pgp逆转剂的标准之一应对正常组织无毒或低毒。COX2在多种不同上皮来源的肿瘤组织中高表达，而在正常组织中几乎不表达，其作为肿瘤靶向治疗的靶点正引起人们的重视。故COX2抑制剂有可能通过调节Pgp的表达而逆转其介导的肿瘤多药耐药，而对正常组织中的Pgp功能影响甚小。因此，COX2抑制剂有可能成为新的安全有效的逆转Pgp介导的肿瘤多药耐药药物。

参考文献

　　[1] Futagami S，Tatsuguchi A，Hiratsuka T，et al. Monocyte chemoattractant protein 1 and CD40 ligation have a synergistic effect on vascular endothelial growth factor production through cyclooxygenase 2 upregulation in gastric cancer[J]. J Gastroenterol， 2008，43(3):216224.

　　[2] Cahlin C，Lnnroth C，Arvidsson A，et al. Growth associated proteins in tumor cells and stroma related to disease progression of colon cancer accounting for tumor tissue PGE2 content[J]. Int J Oncol， 2008，32(4):909918.

　　[3] Surowiak P， Materna V， Matkowski R， et al. Relationship between the expression of cyclooxygenase 2 and MDR1/Pglycoprotein in invasive breast cancers and their prognostic significance[J]. Breast Cancer Res， 2005，7(5):862870.

　　[4] Ohtani H， Ikegawa T， Honda Y， et al. Effects of various methoxyflavones on vincristine uptake and multidrug resistance to vincristine in Pgpoverexpressing K562/ADM cells[J]. Pharm Res， 2007，24(10):19361943.

　　[5] Levchenko A，Mehta B M，Niu X，et al. Intercellular transfer of Pglycoprotein mediates acquired multidrug resistance in tumor cells[J]. Proc Natl Acad Sci， 2005，102:19331938.

　　[6] Saikawa Y， Sugiura T， Toriumi F， et al. Cyclooxygenase2 gene induction causes CDDP resistance in colon cancer cell line，HCT15[J]. Anticancer Res， 2004，24:27232728.

　　[7] 韩正祥，杜秀平，张敬川. 乳腺癌组织中COX2与MDR1/Pgp表达的相关性研究[J]. 临床肿瘤学杂志，2006，11(8)：604611.

　　[8] 林 根， 陈玉丽， 陈志哲， 等. 选择性环氧合酶2抑制剂NS398抑制胃癌细胞P糖蛋白表达[J]. 中华消化杂志，2005，25(9):542545.

　　[9] Castelao J E，Bart R D 3rd，Di Perna C A，et al. Lung cancer and cyclooxygenase2[J]. Ann Thorac Surg， 2003，76:13271335.

　　[10] Sorokin A. Cyclooxygenase2 potential role in regulation of drug efflux and multidrug resistance phenotype[J]. Curr Pham Des， 2004， 10(6):647657.

　　[11] Milella M，Gelibter A，Dicosimo S，et al. Pilot study of celecoxib and infusional 5fluorouracil as secondline treatment for advanced pancreatic carcinoma[J]. Cancer， 2004，101:133138.

　　[12] Altorki N K，Keresztes R S，Port J L，et al. Celecoxib， a selective cyclooxygenase2 inhibitor， enhances the response to preoperative paclitaxel and carboplatin in earlystage nonsmallcell lung cancer[J]. J Clin Oncol， 2003，21:26452650.