SORL1基因多态性与散发性阿尔茨海默病关联分析

　　　　 作者：伍力 王燕 李超 伍星 余发春

【摘要】 　　目的 分析SORL1基因多态性与散发性阿尔茨海默病（SAD）是否存在关联。方法 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）技术，检测114例SAD患者及111例健康对照者的SORL1基因多态性分布特征。结果 SAD组与对照组SORL1基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义（χ2＝1.693，P=0.429，χ2＝0.965，P=0.326）。不同性别的SAD组与对照组SORL1基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义（男性：χ2＝2.324，P=0.313，χ2＝1.667，P=0.197；女性：χ2＝2.878，P=0.237，χ2＝0.058，P=0.810）。结论 亚洲汉族人群SORL1基因rs641120位点的A/G SNP多态性与SAD可能无关联。

【关键词】 阿尔茨海默病；基因表达；多态现象；遗传

　　阿尔茨海默病（AD）是一种多因素引起的原发性退行性脑变性疾病，病因未明〔1〕。AD患者中，除少数为家族性外，绝大多数为散发性。散发性阿尔茨海默病（SAD）的发病是多个基因和环境因素共同作用的结果。目前，定位于19号染色体的载脂蛋白E（APOE）ε4等位基因作为AD的危险因子已得到广泛认同〔2〕，但ε4等位基因并非AD发病的充要条件〔3〕，其发病因素仅占了45%～60%，由此可见尚有其他危险因素参与了AD的发病。研究发现遗传性或获得性的SORL1受体表达或功能改变，可能涉及AD发生的机制〔4，5〕。本研究通过对SAD患者SORL1基因进行多态性检测，探讨SORL1基因多态性与SAD是否存在关联。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　114例SAD患者为2006年9月至2008年3月在我院门诊及住院的患者，各患者间无亲缘关系，其中男44例，女70例，年龄63～85岁，平均(75.1±6.1)岁。均符合中国精神疾病分类方案与诊断标准第三版和美国精神障碍诊断和统计手册第4版(DAMⅣ)的AD诊断标准〔6〕。符合MMSE评分文盲患者≤17分，小学文化患者≤20，中学及以上文化程度患者≤24分。采用Hachinski缺血指数量表结合大脑影像学资料鉴别血管性痴呆和AD，排除抑郁症所引起的假性痴呆，排除其他神经系统疾病、系统性疾病和物质中毒所致的痴呆，排除正处于心、血管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者。111例健康对照老年人选自社区，满足MMSE评分文盲患者≥17分，小学文化患者≥20，中学及以上文化程度患者≥24分。男性41例，女性70例，年龄62～87岁，平均(73.6±6.3)岁。排除正处于心、血 管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者。两组间的年龄、性别差异无统计学意义。

　　1.2 方法

　　1.2.1 位点

　　SORL1 基因接近5′端的rs641120 (A/G)SNP多态性位点。

　　1.2.2 引物

　　上游引物：5′CATGATCCAAATTATATGTGAAAAATTCAAT 3′，错配引物设计，将A转换为C，引入一个MunⅠ（MfeⅠ）的酶切识别序列：C∨AATTG；下游引物：5′CCCAAGAACATCAGGACACCAAC 3′，扩增产物长度为：181 bp。

　　1.2.3 PCR反应条件

　　95℃预变性5 min，然后按96℃ 45 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，循环35次，末次循环后72℃延伸5 min，产物经含EB的2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.2.4 SORL1基因rs641120 (A/G)SNP/MunI限制性片段长度多态性(RFLP)分析 取10 μl扩增产物，加入8个单位MunⅠ内切酶及其缓冲液，37℃消化3 h。3%的琼脂糖凝胶电泳，分离酶切产物片段。溴化乙啶染色后在紫外透射反射仪下分析电泳结果。

　　1.2.5 验证结果

　　各基因型随机抽取5例样本进行基因测序，验证酶切结果。x

【摘要】 　　目的 分析SORL1基因多态性与散发性阿尔茨海默病（SAD）是否存在关联。方法 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）技术，检测114例SAD患者及111例健康对照者的SORL1基因多态性分布特征。结果 SAD组与对照组SORL1基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义（χ2＝1.693，P=0.429，χ2＝0.965，P=0.326）。不同性别的SAD组与对照组SORL1基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义（男性：χ2＝2.324，P=0.313，χ2＝1.667，P=0.197；女性：χ2＝2.878，P=0.237，χ2＝0.058，P=0.810）。结论 亚洲汉族人群SORL1基因rs641120位点的A/G SNP多态性与SAD可能无关联。

【关键词】 阿尔茨海默病；基因表达；多态现象；遗传

　　阿尔茨海默病（AD）是一种多因素引起的原发性退行性脑变性疾病，病因未明〔1〕。AD患者中，除少数为家族性外，绝大多数为散发性。散发性阿尔茨海默病（SAD）的发病是多个基因和环境因素共同作用的结果。目前，定位于19号染色体的载脂蛋白E（APOE）ε4等位基因作为AD的危险因子已得到广泛认同〔2〕，但ε4等位基因并非AD发病的充要条件〔3〕，其发病因素仅占了45%～60%，由此可见尚有其他危险因素参与了AD的发病。研究发现遗传性或获得性的SORL1受体表达或功能改变，可能涉及AD发生的机制〔4，5〕。本研究通过对SAD患者SORL1基因进行多态性检测，探讨SORL1基因多态性与SAD是否存在关联。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　114例SAD患者为2006年9月至2008年3月在我院门诊及住院的患者，各患者间无亲缘关系，其中男44例，女70例，年龄63～85岁，平均(75.1±6.1)岁。均符合中国精神疾病分类方案与诊断标准第三版和美国精神障碍诊断和统计手册第4版(DAMⅣ)的AD诊断标准〔6〕。符合MMSE评分文盲患者≤17分，小学文化患者≤20，中学及以上文化程度患者≤24分。采用Hachinski缺血指数量表结合大脑影像学资料鉴别血管性痴呆和AD，排除抑郁症所引起的假性痴呆，排除其他神经系统疾病、系统性疾病和物质中毒所致的痴呆，排除正处于心、血管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者。111例健康对照老年人选自社区，满足MMSE评分文盲患者≥17分，小学文化患者≥20，中学及以上文化程度患者≥24分。男性41例，女性70例，年龄62～87岁，平均(73.6±6.3)岁。排除正处于心、血 管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者。两组间的年龄、性别差异无统计学意义。

　　1.2 方法

　　1.2.1 位点

　　SORL1 基因接近5′端的rs641120 (A/G)SNP多态性位点。

　　1.2.2 引物

　　上游引物：5′CATGATCCAAATTATATGTGAAAAATTCAAT 3′，错配引物设计，将A转换为C，引入一个MunⅠ（MfeⅠ）的酶切识别序列：C∨AATTG；下游引物：5′CCCAAGAACATCAGGACACCAAC 3′，扩增产物长度为：181 bp。

　　1.2.3 PCR反应条件

　　95℃预变性5 min，然后按96℃ 45 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，循环35次，末次循环后72℃延伸5 min，产物经含EB的2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.2.4 SORL1基因rs641120 (A/G)SNP/MunI限制性片段长度多态性(RFLP)分析 取10 μl扩增产物，加入8个单位MunⅠ内切酶及其缓冲液，37℃消化3 h。3%的琼脂糖凝胶电泳，分离酶切产物片段。溴化乙啶染色后在紫外透射反射仪下分析电泳结果。

　　1.2.5 验证结果

　　各基因型随机抽取5例样本进行基因测序，验证酶切结果。

　　1.3 统计学方法

　　应用SPSS13.0统计软件。计量资料采用t检验；基因型分布和等位基因频率的两组间比较采用χ2检验；HardyWeinberg遗传平衡判断采用χ2吻合度检验。
　
　　2 结果

　　2.1 SORL1基因rs641120位点A/G多态性检测结果

　　G等位基因为MunI酶切识别位点，酶切结果显示共有三种基因型：GG型，酶切后形成153和28 bp两个片段；AA型，仅有181 bp一个片段；AG型有181、153和28 bp三个片段。见图1。各基因型测序结果与酶切结果完全相符。

　　2.2 AD组与对照组SORL1基因型及等位基因频率比较

　　经χ2吻合度检验AD组和对照组均符合HardyWeinberg遗传平衡。AD组与对照组SORL1基因型及等位基因频率分布见表1。经比较显示，两组间基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义。表1 两组SORL1基因型及等位基因频率比较〔略〕

　　2.3 不同性别的AD组与对照组SORL1基因型及等位基因频率比较

　　不同性别的AD组与对照组SORL1基因型及等位基因频率分布见表2。经比较显示，不同性别的AD组与对照组基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义。

表2 不同性别的AD组与对照组SORL1基因型及等位基因频率比较〔略〕

　　3 讨论
　　
　　SORL1受体为膜蛋白，属于低密度脂蛋白受体家族成员，穿梭于质膜、内涵体和高尔基体，在神经元细胞中发挥转运作用。SORL1受体可以阻止APP 形成Aβ，SORL1受体表达减少将导致脑内高水平的Aβ，导致AD的发生。

　　SORL1受体由SORL1基因编码的，SORL1基因位定于人类11号染色体的长臂q23.2－q24.2区域，长度为177.49 kb，也称为LR11或SORLA。2007年Rogaeva等〔5〕首先报道了6个不同种群的SORL1基因序列中的单核苷酸多态性（SNP）研究结果，关联分析表明 SORL1 基因的SNP与迟发性 AD 相关联，但也表现出不同种群的差异性，故推测SORL1变异可能增加神经退行性变的风险，机制可能与抑制基因的活性有关。在此之后，陆续有研究也证实SORL1基因的多态性与AD相关〔7，8〕，但亦有部分研究显示无明显关联〔9，10〕。SORL1基因的区域内存在多个位点的SNP，各研究中位点选择的差异及各研究中研究样本的差异（如研究对象种群的差异，研究时诊断标准、纳入标准的差异），可能是各研究结果不一致的原因。
　　
　　本研究对SORL1基因rs641120位点的A/G SNP多态性分析结果显示，AD组与对照组该位点基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义，不同性别的D组与对照组该位点基因型及等位基因频率分布差异亦无统计学意义。该位点位于5′端的内含子中，Rogaeva等〔5〕的研究显示，以色列阿拉伯人该位点与散发性AD相关联，而北欧人中未发现此种关联。Joseph等〔11〕对非裔美国人、加勒比西班牙人、北欧人的研究显示，未发现该位点的多态性与散发性AD相关联。本研究结果提示亚洲汉族人群，SORL1基因rs641120位点的A/G SNP多态性与散发性AD无关联。
　　
　　综上所述，由于SORL1基因的其他区域存在多个位点的SNP，要了解该基因与散发性AD之间的关系，今后还应选择更多的位点进行更大规模的研究。

参考文献

　　1 Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress andproblems on the road to therapeutics〔J〕.Science，2002；298(5595)：9624.

　　2 Bertram L，Tanzi RE.The current status of Alzheimer′s disease genetics：what do we tell the patients〔J〕?Pharmacol Res，2004；50(4)：38596.

　　3 Farrer LA，Cupples LA，Haines JL，et al.Effects of age，sex，and ethnicity on the association between apolipoprotein E genotype and Alzheimer disease.A metaanalysis.APOE and Alzheimer Disease Meta Analysis Consortium〔J〕.JAMA，1997；278（16）：134956.

　　4 Offe K，Dodson SE，Shoemaker JT，et al.The lipoprotein receptor LR11 regulates amyloid beta production and amyloid precursor protein traffic in endosomal compartments〔J〕.J Neurosci，2006；26(5)：1596603.

　　5 Rogaeva E，Meng Y，Lee JH，et al.The neuronal sortilinrelated receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease〔J〕.Nat Genet，2007；39(2)：16877.

　　6 American Psychiatry Association. Diagnostic and statistical manual of mental disorders，fourth edition(DSMⅣ)〔M〕.Washington DC APA，1994：2568.

　　7 Klsch H，Jessen F，Wiltfang J，et al.Influence of SORL1 gene variants：association with CSF amyloidbeta products in probable Alzheimer′s disease〔J〕.Neurosci Lett，2008；440(1)：6871.

　　8 Tan EK，Lee J，Chen CP，et al.SORL1 haplotypes modulate risk of Alzheimer′s disease in Chinese〔J〕.Neurobiol Aging，2009；30(7)：104851.

　　9 Webster JA，Myers AJ，Pearson JV，et al.Sorl1 as an Alzheimer′s disease predisposition gene〔J〕? Neurodegener Dis，2008；5(2)：604.

　　10 Li Y，Rowland C，Catanese J，et al.SORL1 variants and risk of lateonset Alzheimer′s disease〔J〕.Neurobiol Dis，2008；29(2)：2936.

　　11 Joseph LH，Rong Cheng，Nicole Schupf，et al.The association between genetic variants in SORL1 and alzheimer disease in an urban，multiethnic，communitybased cohort〔J〕.Arch Neurol，2007；64(4)：5016.