促红细胞生成素对心肌梗死大鼠血流动力学及梗死面积的影响

　　　　作者：赵玉伟 李法琦 邱炯 周平 李万玉 黄妍

【摘要】 目的 探讨重组人促红细胞生成素(rhEPO)对大鼠急性心肌梗死(AMI)后24 h血流动力学和左心室梗死面积的影响。方法 24只雄性SD大鼠随机分为假手术组、AMI组和EPO组，结扎左冠状动脉前降支建大鼠AMI模型，EPO组同时给予rhEPO 5 000 U/kg腹腔内注射;24 h后记录大鼠血流动力学参数并计算左心室梗死区与左心室质量比值。结果 AMI组各项血流动力学参数均明显下降;EPO组血流动力学参数均明显改善(P&<0.05，P&<0.01)，尤其反映心肌舒张功能的指标改善更显著(P&<0.01);EPO明显降低左心室梗死区与左心室质量比值(P&<0.05)。结论 EPO急性干预缩小大鼠AMI后的梗死面积并明显改善其血流动力学参数，尤其对舒张功能改善更为明显。

【关键词】 促红细胞生成素;心肌梗死;血流动力状况;梗死面积;大鼠

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of erythropoietin (EPO) on the 24 hours hemodynamic status and infarct area of the left ventricle in rats after acute myocardial infarction (AMI). Methods 24 male SD rats were recruited and pided into 3 groups at random: shamoperated， AMI and EPO groups. AMI rat model was created by ligating left anterior descending coronary artery. The rats in EPO group were treated at same time with intraperitoneal injection of recombinant human EPO (rhEPO， 5 000 U/kg). The hemodynamic parameters including blood pressure (BP)， left ventricular systolic pressure (LVSP)， maximal rate of increase of ventricular pressure (dp/dtmax)， left ventricular diastolic pressure (LVDP)， maximal rate of decrease of ventricular pressure (dp/dtmin) and left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) in rats 24 hours after operation were determined. The size of infarct myocardial tissue and the ratio of the weight of infarct myocardial tissue as well as that of the whole left ventricle were measured. Results Compared with shamoperated group， all hemodynamic parameters of rats declined remarkably in AMI group. Compared with AMI group， all hemodynamic parameters of rats in EPO group were improved in different degrees: LVSP and dp/dtmax related to cardiac systolic function were slightly improved but the differences were not significant (P&>0.05); LVDP， LVEDP as well as dp/dtmin associated with cardiac diastolic function were remarkably improved (P&<0.05 or P&<0.01); mean arterial pressure (MAP) showed no difference (P&>0.05). The area of infarct myocardial tissue in the left ventricle and the ratio of the weight of infarct myocardial tissue as well as that of the whole left ventricle in EPO group were significantly reduced compared to those in AMI group (P&<0.05). Conclusions Application of EPO can ameliorate the hemodynamic parameters in rats with AMI， especially improve the cardiac diastolic function. Treatment of EPO can reduce the myocardial infarct area of AMI rats.

　　【Key words】 Erythropoietin; Myocardial infarction; Hemodynamic status; Infarct area; Rat

　　促红细胞生成素(EPO)是由成人肾脏分泌的分子量为34 kD的调节红细胞生成的生长因子，它通过抗细胞凋亡的机制来促进红系祖细胞的增殖、分化和成熟。缺氧诱导因子1(HIF1)是由HIF1α和HIF1β两个亚单位组成的异二聚体，在缺氧应激状态下，HIF1的两个亚单位结合后进入细胞核，结合并激活位于EPO启动子上的缺氧反应元件，从而促进EPO的转录和表达。由于EPO可以促进红细胞的生成来满足组织和器官的氧供应，重组人EPO(rhEPO)的应用已经成为慢性肾衰、艾滋病病毒(HIV)感染和肿瘤化疗病人贫血的标准治疗〔1〕。有研究发现EPO是一种重要的细胞保护因子，对缺血缺氧性损伤的大脑、肾脏和心脏等多种器官组织起保护作用〔2，3〕。EPO受体(EPOR)不仅分布于红系祖细胞，而且也分布于肾脏细胞、内皮与平滑肌细胞、心肌细胞和星型胶质细胞等多种细胞。EPO与其受体结合后通过自分泌和旁分泌来发挥它的生物学作用〔4〕。氨甲酰EPO(CEPO)不能与红系祖细胞的EPOR相结合，因而不具备促红细胞生成的作用。然而CEPO能够在中毒性脑损伤和心肌缺血性损伤的动物模型中起到细胞保护作用〔5〕，提示EPO并非通过促进红细胞生成而发挥细胞保护作用。EPO作为细胞生长因子发挥细胞保护作用的研究大多为体外研究，体内研究较少。本文通过大鼠急性心肌梗死(AMI)模型探讨EPO单次干预对AMI大鼠血流动力学和心肌梗死面积的影响，为进一步研究其作用机制打下基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠24只，购于重庆医科大学实验动物中心，体重(240±20) g。

　　1.2 主要仪器及试剂 动物人工呼吸机购于浙江医科大学医学实验仪器厂;BL410生物机能实验系统购于泰盟科技公司;三通输液治理及压力检测旋塞系统购于德国贝朗梅尔松根公司;FA1004型电子天平购于上海精密科学仪器公司;60号带线缝合针购于上海浦东金环医疗用品有限公司;rhEPO注射液(益比奥)购于沈阳三生制药有限公司;TTC购于美国Amresco公司;水合氯醛购于上海化学试剂公司。

　　1.3 实验动物分组 将大鼠随机分为假手术组、AMI组和EPO组，每组8只，手术后24 h测定大鼠血流动力学参数并处死取材。

　　1.4 AMI动物模型的建立 采用3.5%水合氯醛1 ml/100 g体重腹腔内注射麻醉，常规消毒，做气管切开插管，接动物呼吸机，设潮气量2.5 ml/100 g，频率为70次/min。沿左侧胸骨旁斜行切口，依次切开皮肤，浅筋膜和深筋膜，钝性分离胸大肌和前锯肌交接处，从3、4肋间进胸，撑开肋骨暴露心脏，提起心包壁层，剪开心包，在肺动脉圆锥和左心耳之间可见呈白色的左冠状动脉前降支，向上推开左心耳，在距主动脉根部约2.5～3 mm处用60带线缝合针穿过左冠状动脉前降支深部并结扎，此时可见其供血区域变白，若冠状静脉被扎可见此区域变为暗红色。观察大鼠心电图的动态变化，若出现宽大畸形类似左束支传导阻滞样QRS波群并持续30 min以上则为结扎成功。检查心脏无出血时关胸，待大鼠出现吞咽动作后拔除气管插管。术毕腹腔内注射青霉素40万U以预防感染，并在30℃条件下苏醒。EPO组结扎冠状动脉成功的同时给予5 000 U/kg rhEPO腹腔内注射，AMI组结扎冠状动脉成功给予等量生理盐水，假手术组只穿线不结扎，不给予任何药物。

　　1.5 血流动力学参数测定 用三通管连接压力换能器和塑料导管，将三通管和塑料导管预先注满37.5 U/ml的肝素钠生理盐水，排尽气泡。水合氯醛腹腔内注射麻醉大鼠，在大鼠颈部右侧剪开皮肤，逐层钝性分离筋膜、肌肉直至颈动脉鞘，分离出颈总动脉1～1.2 cm，眼科剪剪开颈总动脉，插入导管约1～1.5 cm，15 min后记录血压(BP)和平均动脉压(MAP)，然后继续插入导管至左心室，此时可明显感觉到导管的波动感，从BL410生物技能实验系统的血流动力学模式下可以观察到左心室压力曲线，稳定10 min后记录左心室收缩压(LVSP)、心室收缩期室内压上升的最大速率(dp/dtmax)、左心室舒张压(LVDP)、心室舒张期室内压下降的最大速率(dp/dtmin)和左心室舒张末期压力(LVEDP)。

　　1.6 心脏标本的留取 测定血流动力学参数后处死大鼠，摘取心脏，去除左右心房及右室壁，将左心室用锡箔纸包裹后置于-20℃冰箱贮存备用。

　　1.7 心肌梗死区TTC染色 从心尖至心底横切成2 mm的心肌组织片然后置于TTC染液中避光、振荡，37℃恒温染色5～10 min，时时翻动组织，保证组织浸泡于染液中，自来水漂洗2次，10%甲醛固定10 min。取出组织，即可观察到梗死心肌为白色，而存活心肌被染为砖红色。

　　1.8 计算左心室梗死区与左心室质量比值 将染色后的心肌切片用吸水纸吸去水分后用分析天平称取总质量，然后用剪刀分离梗死区和非梗死区，称取梗死区质量。梗死区与左心室质量比值=梗死区质量/左心室质量×100%。

　　1.9 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以x±s表示，组间两两比较采用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组之间血流动力学参数的比较

　　2.1.1 左心室收缩功能(LVSP和dp/dtmax)的比较 与假手术组比较，LVSP和dp/dtmax在AMI后均明显下降(P&<0.05)，与AMI组比较，EPO组LVSP和dp/dtmax虽有所改善而升高，但没有统计学差异(P&>0.05)。见表1。表1 各组间左心室收缩功能的比较

　　2.1.2 左心室舒张功能(LVDP和dp/dtmin)的比较 与假手术组比较，AMI组LVDP明显升高，而dp/dtmin明显下降(P&<0.01，P&<0.05)，与AMI组比较，EPO组LVDP和dp/dtmin均明显改善，具有统计学意义(P&<0.01，P&<0.05)。见表2。表2 各组间左心室舒张功能的比较

　　2.1.3 MAP和LVEDP的比较 与假手术组比较，AMI组MAP明显下降，LVEDP明显升高(P&<0.05，P&<0.01)，与AMI组比较，EPO组MAP无明显差异，但LVEDP却显著下降(P&<0.01)。见表3。

　　2.2 梗死区与左心室质量比值的比较 左室心肌薄片经TTC染色后可以清楚看到梗死区为白色，而非梗死区被染为砖红色，称取各部分质量后计算其比值。与AMI组比较，EPO组梗死区与左心室质量比值明显下降(21.73±4.14 vs 17.95±2.66)，差异具有统计学意义(P&<0.05)。

　　表3 各组间MAP和LVEDP的比较

　　3 讨 论

　　3.1 EPO干预对AMI血流动力学的影响 本实验证实，EPO干预可以全面改善AMI后的血流动力学参数，但对与心肌收缩功能相关的血流动力学参数改善不明显。Moon等〔6〕在结扎大鼠冠状动脉的当时一次给予rhEPO 3 000 U/kg，8 w后用超声测定左心室功能，发现rhEPO明显改善AMI大鼠的左心室功能，但对左心室收缩末期容积、舒张末期容积和射血分数影响不明显。Lipsic等〔7〕在大鼠缺血或再灌注时给予rhEPO 5 000 U/kg，24 h后测定血流动力学参数，发现LVEDP和dp/dtmin改善显著，但LVSP、dp/dtmax和MAP改善不明显，与本文的结果一致。Hale等〔8〕在大鼠心肌梗死模型用rhEPO 5 000 U/kg连续干预7 d后测定左心室收缩功能和舒张功能，结果发现rhEPO组梗死面积、左心室大小、左心室收缩期容积和射血分数均没有明显改善，只是在相同的梗死面积下左心室射血分数和收缩末期容积有改善趋势。其原因可能为rhEPO的细胞保护作用与其剂量有关。在缺氧条件下rhEPO对内皮细胞发挥保护作用，但当rhEPO浓度低于0.1 ng/ml或高于10 ng/ml时，rhEPO的保护作用消失〔9〕;EPO可以改善缺血情况下离体兔心脏的收缩功能，但只有缓冲液中EPO的浓度在0.5～5.0 U/ml之间才有效果〔10〕。除剂量外，EPO的干预时间同样重要，在心脏缺血或再灌注的当时给予rhEPO干预比缺血前2 h干预能发挥更大的心脏保护作用〔7〕。仔细观察Hale等〔8〕的研究发现，EPO干预在结扎冠状动脉前24 h就已经开始，并且连续应用7 d，7 d后红细胞压积已明显升高，因而推测没有阳性结果可能与其rhEPO干预时机和剂量偏大导致副作用产生有关。本研究没有对其远期血流动力学状况进行评估，其对MAP、LVSP和dp/dtmax没有产生明显影响，推测可能与急性期交感神经系统兴奋和左心室舒张末期容积增加引起的血管自身调节减压反射(也称starling定律)机制的急性代偿有关。

　　3.2 EPO干预对AMI梗死面积的影响 梗死面积的大小直接决定着心功能的状态，本研究中以梗死区与左心室质量比值来代替梗死面积，结果发现rhEPO的应用能够明显缩小AMI大鼠的心肌梗死面积。Lipsic等〔7〕在大鼠缺血再灌注模型发现，给予rhEPO 5 000 U/kg后24 h心肌梗死面积与对照组相比减少18.9%～22.8%。Moon等〔6〕在结扎大鼠冠状动脉后单次给予rhEPO 3 000 U/kg，8 w后测定发现EPO组的左心室梗死面积只相当于对照组的15%～25%，其差异非常显著。细胞坏死和梗死区的扩展主要发生于缺血性损害后的前3 d，EPO缩小梗死面积可能归功于它的促血管生成作用。在心内膜内皮细胞培养液中加入EPO可以明显加快新生血管的形成，其效果甚至可以和血管内皮生长因子(VEGF)相媲美〔11〕，新生血管的自然形成主要发生于缺血后的1～3 w，而EPO可以明显使这一时间提前。尽管rhEPO介导的新生血管形成不大可能在冠状动脉结扎后24 h内产生，但研究发现rhEPO可以增加一氧化氮(NO)的效用〔12〕。由此推测，NO介导的血管扩张和促进侧支循环形成在早期缩小心肌梗死面积方面起重要作用。有研究证实rhEPO能够刺激神经和内皮祖细胞的分化〔13，14〕，因此rhEPO动员未分化细胞进入缺血心肌组织并刺激其分化可能也是其缩小心肌梗死范围的一个机制。本研究rhEPO治疗缩小心肌梗死面积不如其他研究显著，可能与梗死后24 h rhEPO还未发挥其全部的细胞保护作用有关。

参考文献

　　1 Li F，Chong ZZ，Maiese K.Erythropoietin on a tightrope：balancing neuronal and vascular protection between intrinsic and extrinsic pathways〔J〕. Neurosignals，2004;13(6):26589.

　　2 Brines ML，Ghezzi P，Keenan S，et al.Erythropoietin crosses the bloodbrain barrier to protect against experimental brain injury〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(19):1052631.

　　3 Vesey DA，Cheung C，Pat B，et al.Erythropoietin protects against ischaemic acute renal injury〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2004;19(2):34855.

　　4 Maiese K，Li F，Chong ZZ.New avenues of exploration for erythropoietin〔J〕.JAMA，2005;293(1)：905.

　　5 Fiordaliso F，Chimenti S，Staszewsky L，et al.A nonerythropoietic derivative of erythropoietin protects the myocardium from ischemiareperfusion injury〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2005;102(6):204651.

　　6 Moon C，Krawczyk M，Ahn D，et al.Erythropoietin reduces myocardial infarction and left ventricular functional decline after coronary artery ligation in rats〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003;100(20):116127.

　　7 Lipsic E，van der Meer P，Henning RH，et al.Timing of erythropoietin treatment for cardioprotection in ischemia/reperfusion〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2004;44(4):4739.

　　8 Hale SL，Sesti C，Kloner RA，et al.Administration of erythropoietin fails to improve longterm healing or cardiac function after myocardial infarction in the rat〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2005;46(2):2115.

　　9 Chong ZZ，Lin SH，Kang JQ，et al.Erythropoietin prevents early and late neuronal demise through modulation of Atk1 and induction of caspase 1，3，and 8〔J〕.J Neurosci Res，2003;71(5):65969.

　　10 Shi Y，Rafiee P，Su J，et al.Acute cardioprotective effects of erythropoietin in infant rabbits are mediated by activation of protein kinases and potassium channels〔J〕.Basic Res Cardiol，2004;99(3):17382.

　　11 Jaquet K，Krause K，TawakolKhodai M，et al.Erythropoietin and VEGF exhibit equal angiogenic potential〔J〕.Microvasc Res，2002;64(2):32633.

　　12 Squadrito F，Altavilla D，Squadrito G，et al.Recombinant human erythropoietin inhibits iNOS activity and reverts vascular dysfunction in splanchnic artery occlusion shock〔J〕.Br J Pharmacol，1999;127(2):4828.

　　13 Shingo T，Sorokan ST，Shimazaki T，et al.Erythropoietin regulates the in vitro and in vivo production of neuronal progenitors by mammalian forebrain neural stem cells〔J〕.J Neurosci，2001;21(24):973343.

　　14 Heeschen C，Aicher A，Lehmann R，et al.Erythropoietin is a potent physiologic stimulus for endothelial progenitor cell mobilization〔J〕. Blood，2003;102(4):13406.