作者：宋芳 郝奋 黄世琪 杨美霞 何金鑫
【摘要】 目的：揭示CXCR1和CXCR2对小鼠胚泡着床的影响及其具体作用环节。方法：建立小鼠胚泡与人蜕膜细胞共培养着床模型，观察抗CXCR1和抗CXCR2抗体对小鼠胚泡粘附和铺展的影响。结果：抗CXCR1抗体不影响胚泡的粘附率，但使铺展率和扩展面积明显下降，且呈剂量依赖关系;抗CXCR2抗体使胚泡的粘附率和铺展率均下降。结论：胚泡的粘附和铺展是由不同的白细胞介素-8受体介导的，CXCR1不影响胚泡的粘附，对滋养层细胞的铺展有促进作用;CXCR2既促进胚泡的粘附又促进滋养层细胞的铺展。
【关键词】 CXCR1;CXCR2;共培养;着床;胚泡;小鼠
Abstract Objective: To reveal the role of CXCR1 and CXCR2 in the process of mouse blastocyst implantation. Methods: Using the implantation model of both mouse blastocysts and human decidul cells co-cultured， we observed the influences of anti-CXCR1、CXCR2 antibodies on the attachment and outgrowth of mouse blastocysts. Results: Anti-CXCR1 antibodies did not affect the rate of attachment and the rate of outgrowth and spreading area are inhibited significantly in a dose-dependent way. The attachment and outgrowth of blastocysts were inhibited obviously by anti-CXCR2 antibodies. Conclusion: The attachment and outgrowth of mouse blastocysts are mediated by different IL-8 receptors.CXCR1 has no effect on the attachment of blastocyst， but can promote the attachment promotes the outgrowth of trophoblast cells. CXCR2 can promote the attachment and outgrowth of blastocysts.
Key words CXCR1; CXCR2; Co-culture; Implantation; Blastocyst; Mouse
白细胞介素-8受体(Interleukin-8 receptor，IL-8R)是G蛋白藕联受体[1]，属于CXCR家族的成员，目前已知有CXCR1和CXCR2两种类型[2]。成功着床所具备的条件是胚泡具有侵入性且子宫内膜具有接受性。胚泡与子宫内膜的粘附及侵入涉及细胞-细胞、细胞-细胞外基质之间的相互作用，白细胞介素-8及其受体在这个过程中起着重要作用。我们用免疫组织化学染色技术检测发现妊娠早期小鼠子宫内膜持续表达CXCR2，并且有一定的规律性，推测白细胞介素-8受体与胚泡着床密切相关[3]，但具体作用环节还不完全清楚。本实验利用小鼠胚泡与人蜕膜细胞共培养着床模型，揭示CXCR1和CXCR2在小鼠胚泡着床过程中的具体作用。
1 材料与方法
1.1 人子宫蜕膜细胞的分离 蜕膜组织来源于北京大学第三医院妇产科妊娠5～6周的人工流产妇女，年龄25～34岁，平均年龄30岁，月经周期正常，3个月内未用任何激素类药物。取材后按Yoshimura的方法分离纯化蜕膜细胞[4]，以5×105 个/mL密度接种于50 mL细胞培养瓶内，37 ℃、5 % CO2培养箱培养，隔天换液，约10 d细胞铺满瓶底。用0.125 %胰蛋白酶+0.02 % EDTA消化，传代并取部分第三代细胞培养于加有盖玻片的培养皿中，培养3 d后取出盖片，在4 %多聚甲醛中固定10 min，用小鼠抗人波形蛋白抗体(1∶100)行免疫组化ABC法检测蜕膜细胞纯度。
1.2 胚泡的获取 成年昆明种雌鼠(购自中国科学院动物研究所)腹腔注射10 IU孕马血清促性腺激素(PMSG)进行超数排卵，48 h后注射10 IU人绒毛膜促性腺激素(HCG)，随后与同品系雄鼠1∶1合笼，次日晨发现阴栓者为妊娠1 d。取妊娠4 d雌鼠子宫，于解剖镜下用PBS缓冲液冲洗双侧子宫角，收集发育一致的胚泡用于实验。
1.3 小鼠胚泡与人蜕膜细胞共培养 取第三代人蜕膜细胞，以1×106 个/mL密度加入到含15 % FCS-199的培养皿中培养，待细胞增殖生长成层后，实验组分别换用经0.4 % BSA-199稀释的不同浓度(100、200、400 ng/mL)抗CXCR1或CXCR2抗体(购自美国Santa Cruz公司)，对照组不加抗体，只用0.4 % BSA-199。每皿移入15～20个未去透明带的胚泡，于培养24 h、48 h和72 h时在倒置显微镜下观察记录胚泡的粘附和铺展情况，以快速轻晃培养皿时胚泡不移动者为粘附;已粘附的胚泡滋养层细胞外延生长等于或超过80 μm者为铺展。分别于共培养24 h、48 h统计粘附率和铺展率，于共培养72 h用显微镜目测栅测量并计算铺展面积。相同实验至少重复3次，每组观察35～40个胚泡。
1.4 统计学处理 胚泡的粘附率、铺展率及扩展面积用x±s来表示，数据采用单因素方差分析及t检验法进行统计学处理。
2 结果
2.1 抗CXCR1抗体对小鼠胚泡粘附、铺展及扩展面积的影响 胚泡能正常孵出、粘附，但其外延生长明显受到抑制，各浓度组共培养72 h的铺展情况见图1、图2、图3、图4。资料经统计后发现，3个不同浓度抗体组的粘附率分别与对照组比较，差异无统计学意义(P&>0.05);统计铺展率：100 ng/mL组、200 ng/mL组、400 ng/mL组均较对照组低，差异有统计学意义(P&<0.05，P&<0.01)。共培养72 h抗体组胚泡的扩展面积以剂量依赖的方式受到抑制，均明显低于对照组(P&<0.01)。见表1。
2.2 抗CXCR2抗体对小鼠胚泡粘附、铺展及扩展面积的影响 胚泡正常孵出后，其粘附受到暂时抑制，共培养48 h才能粘附，此时不能外延生长;72 h时虽已外延生长，但扩展面积较对照组减小，见图5、图6、图7、图8。共培养24 h时统计各组粘附率，均明显低于对照组(P&<0.01);各组铺展率分别与对照组相比，差异均有统计学意义(P&<0.01)。共培养72 h时3个不同浓度组的胚泡扩展面积均明显低于对照组(P&<0.01)。见表1。
3 讨论
近年来，人们认为IL-8与其相应的受体CXCR1或CXCR2结合，从而趋化和激活中性粒细胞发挥作用[5]。1998年Iwabe等[6]通过实验证实在子宫内膜上皮细胞和基质细胞中有CXCR1 mRNA的表达，并且一些学者研究发现，在正常月经周期子宫内膜上皮细胞和基质细胞中均有CXCR1和CXCR2蛋白的表达[7-9]。
为了研究CXCR1和CXCR2在小鼠胚泡着床过程中的具体作用环节，我们在汇合成层的人蜕膜细胞中分别加入不同浓度抗CXCR1、CXCR2抗体，与小鼠胚泡共培养，在倒置显微镜下观察并统计粘附率、铺展率及扩展面积。从各实验组结果看，抗CXCR1抗体不影响胚泡的粘附，但明显抑制其铺展，并且这种抑制作用呈剂量依赖关系;抗CXCR2抗体对胚泡的粘附和铺展均有抑制作用。在此之前我们曾报道：在体外无血清培养模型中，抗IL-8抗体也抑制胚泡的粘附和铺展[10]。由此可见，胚泡的粘附和铺展是IL-8受体介导的，在胚卵着床的不同时期IL-8与不同的受体结合而发挥作用。
总之，在胚泡的着床过程中，滋养层细胞的粘附和铺展由不同的IL-8受体介导，CXCR1不影响胚泡的粘附，对滋养层细胞的铺展有促进作用;CXCR2既促进胚泡的粘附又促进滋养层细胞的铺展。由此说明CXCR1和CXCR2参与小鼠胚泡着床，并且作用环节不同，对着床过程的影响亦不同。
参考文献
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