作者：付玉华 吕军 周立社 邵国 姜树原 龚向峰 闫少春
【摘要】 目的:探讨钒化钠对人食管癌细胞系EC109 MAPK信号通路中ERK1/2表达的影响。方法:用半定量 Western-blot方法检测 ERK1/2蛋白的表达水平。结果:一定浓度的钒化钠对食管癌细胞系EC109 MAPK信号通路中ERK1/2表达有抑制作用。结论:一定浓度的钒化钠能明显抑制食管癌细胞系EC109细胞株的生长，钒化钠的抗肿瘤机制可能与 ERK1/2蛋白表达水平降低有关。
【关键词】 钒化钠;食管癌;信号转导;ERK1/2
Abstract Objective: To evaluate the effect of sodium vanadate on the expression of ERK1/2 in the esophageal cancer cell line EC109. Methods: Western blot analysis was applied to determine modification of ERK1/2 proteins. Results: The expression of ERK1/2 was evidently decreased by sodium vanadate of certain concentration. Conclusion: Sodium vanadate significantly inhibits the proliferation of human esophageal cell line EC109. The antitumor mechanism of Sodium vanadate may be related to down-regulation of ERK1/2 expression.
Key words Sodium vanadate; Esophageal cancer; Signal transduction; ERK1/2
钒的药理作用报道最多的是它的降血糖作用[1]。随着对钒研究的深入，其抗癌作用也引起人们的注意。Ray等[2]研究显示钒化钠可以促进乳腺癌MCF7细胞凋亡抑制其增殖，显示了钒化钠作为有效的化疗制剂的潜能。我们前期研究显示，一定浓度的钒化钠能明显抑制食管癌细胞系EC109细胞株的生长，钒化钠的抗肿瘤机制可能与cyclin D1蛋白表达降低有关[3]。本研究进一步揭示钒化钠抗肿瘤作用的分子机制，扩大其抗肿瘤谱，为钒化钠进一步发展成一种新型的抗肿瘤药物提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 药品及抗体 钒化钠购买于北京化学试剂公司，纯度为分析纯。RPMI1640培养基购自Gibco公司。胎牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司。二甲基亚砜、十二烷基硫酸钠、丙烯酰胺等化学试剂购自Sigma公司。BCA蛋白分析试剂盒购自PIERCE公司。抗actin兔多克隆抗体、抗ERK1/2兔多克隆抗体、辣根酶标记的山羊抗兔IgG均购自Santa Cruze公司。ECL反应试剂盒购自PIERCE公司。
1.2 细胞株 人食管癌细胞系EC109购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。食管癌细胞系EC109在37 ℃、饱和湿度及5 % CO2条件下，用培养瓶在含10 %胎牛血清、1×105 U/L青链霉素的RPMI1640培养液中传代培养。
1.3 免疫蛋白印迹实验(Western-blot) 将食管癌细胞系EC109悬液接种于6孔培养皿中，培养至贴壁面积达80 %～90 %时弃去培养液，换上无血清培养基培养12 h，按实验分组分别加入不同浓度的钒化钠，分别为1.0 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L、50.0 μmol/L、100.0 μmol/L、200.0 μmol/L，对照组不加药物。作用12 h后，用RIPA+PMSF细胞裂解液在冰上裂解细胞，低温离心15 min提取蛋白，BCA法蛋白定量。加上样缓冲液，100 ℃变性5 min。每孔50 μg蛋白上样，10 % SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白电转到硝酸纤维膜上，用5 %脱脂奶粉封闭1 h，加一抗稀释液(1∶1 000稀释)4 ℃过夜，TTBS洗膜，结合辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5 000稀释)，TTBS洗膜，用ECL化学发光试剂在X光胶片上曝光、显影、定影。以actin为内参照，应用凝胶成像分析系统进行条带扫描分析结果，结果以蛋白条带的面积积分值与actin的面积积分值比值表示。实验重复3次。
1.4 统计学处理 采用SPSS 11.0软件包对数据进行单因素方差分析，统计数据以均数±标准差(x±s)表示，P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
实验结果显示，在50.0～200.0 μmol/L的浓度范围内随着药物浓度的增加，药物处理时间的延长，ERK1/2蛋白表达量呈现逐渐下降的趋势。见图1，表1。表1 ERK1/2蛋白表达的灰度测定比值
3 讨论
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，寻找有效的化疗药物成为食管癌治疗领域研究的热点。钒化钠以其无致命不良反应而用于糖尿病病人的干预治疗[4]，表明钒化钠作为临床治疗药物的潜在可能性。Bishayee等[5]报道了一系列钒制剂对动物模型系统的抗肿瘤活性。生长细胞对钒化钠的毒性作用更敏感，通过皮下注射，钒化钠很有效地抑制了小鼠肿瘤生长，抑制癌细胞生长增殖[6]。本研究利用Western-blot研究方法，分析钒化钠对肿瘤细胞生长的抑制作用及其分子机制。为进一步将钒化钠研发成一种新的化疗药物提供理论基础。
ERK1/2信号转导通路是近年来研究的热点，它是介导细胞外刺激到细胞内反应的重要信号转导系统，在细胞增殖过程中起重要调节作用[7]。研究表明，作为重要的细胞周期相关蛋白激酶途径，ERK1/2信号途径受到抑制是多种细胞凋亡的一个重要原因，这主要是因为ERK1/2激酶与Bcl-2家族蛋白有着密切的关系，ERK1/2的激活不但可以上调Bcl-2等抗凋亡蛋白的表达，而且可以诱导其活化[8-9]。实验观察了钒化钠对食管癌细胞株EC109细胞ERK1/2表达的影响。研究发现在一定的作用时间范围内，低浓度钒化钠组对ERK1/2蛋白表达无影响，而高浓度钒化钠可下调食管癌细胞株EC109细胞中ERK1/2蛋白的表达，这一变化趋势与MTT的结果基本一致[3]。提示钒化钠可能通过抑制ERK1/2蛋白的表达进而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用，这一结果为钒化钠防治食管癌的临床应用奠定理论基础。由于细胞凋亡是一个极其复杂、涉及多步骤、多因子参与的过程，故钒化钠诱导肿瘤细胞凋亡的详细机制仍需进一步研究。
参考文献
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