人大肠癌抗原基因 cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定

【摘要】 　　目的: 为获得大肠癌的特异性抗原基因， 构建人大肠癌抗原基因的 cDNA噬菌体表达文库。方法: 从2株人大肠癌细胞CCL187和CX1中提取总RNA， 分离纯化mRNA， 并以此为模板合成第1 链 cDNA， 用置换法合成第2 链 cDNA。双链 cDNA 经末端削平、 EcoRⅠ接头连接、 XhoⅠ 酶切、 过柱分级分离， 除去&<400 bp 片段。收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接， 体外包装后获得人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库。结果: 构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体文库， 原始库容量为2.3×109 pfu/L， 重组率97%。重组子插入cDNA片段平均大小1 kb以上。结论: 成功地构建高质量的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库， 为大肠癌的特异性抗原筛选奠定了基础。

【关键词】 人大肠癌; 噬菌体; cDNA表达文库

　　［Abstract］ AIM: To construct a cDNA phage expression library of colorectal carcinoma antigens for screening colorectal carcinoma specificantigens. METHODS: The total RNA was extracted from two colorectal carcinoma cell lines CCL187 and CX1 . The mRNA from total RNA was isolated to synthesize the first and second strand cDNA. The dscDNA termini were blunted with pfu DNA polymerase. The blunted cDNAs were ligated with EcoRⅠadapters and then digested by XhoⅠ. Small cDNA molecules（&<400 bp）were removed through size fraction. After the cDNAs were inserted into ZAP expression vector， the ligated products were packaged in vitro and the bacteriophage particles infected the host strains XL1Blue MRF′. RESULTS: The efficiency of the primary was 2.3×109 pfu/L， while the recombination rate reached to 97%. The average length of the inserted fragment was over 1 kb. CONCLUSION: The quality of colorectal carcinoma cDNA phage expression library is excellent and helpful to screen colorectal carcinoma specificantigens.

　　［Keywords］colorectal carcinoma; bacteriophage; cDNA expression library

　　大肠癌是消化系统的常见恶性肿瘤之一， 死亡率有逐年上升的趋势。因此早期诊断和治疗是提高大肠癌治愈率的关键［1］。我们已成功制备了以人大肠癌细胞系CCL187为免疫源的鼠抗人大肠癌单克隆抗体(mAb) ND1［2］， 进一步筛选和鉴定ND1 mAb所识别的特异性大肠癌抗原， 可为大肠癌早期诊断和免疫治疗提供新的靶点。而寻找抗原基因的最有效方法是构建cDNA文库 ， 继而进行筛选、 克隆。国内外已开展大肠癌cDNA文库构建和大肠癌相关肿瘤抗原筛选方面的研究［3， 4］。本实验中用2株人大肠癌细胞系CCL187和CX1作为构建文库的材料来源， 以λ ZAP Express为载体， 构建了人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 CCL187和CX1人大肠癌细胞株由美国哈佛大学医学院肿瘤所惠赠。TRIzol试剂购自美国Invitrogen 公司; DMEM培养基购自Gibco公司; mRNA分离纯化试剂盒购自德国Qiagen公司; ZAP Express cDNA Synthesis Kit和ZAP Express cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit 购自美国Stratagene 公司。LB 培养基胰蛋白冻、 酵母提取物购自 Oxoid LTD; 盐酸四环素购自 Amresco 公司; 异丙基硫代βD半乳糖苷 (IPTG) 、 5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷( Xgal)为TaKaRa公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 RNA提取和纯化 培养人大肠癌细胞CCL187和CX1至对数生长期， 倒去培养液， 用PBS冲洗后加入TRIzol试剂， 裂解细胞并抽提总RNA， 用Qiagen的mRNA分离纯化试剂盒分离纯化mRNA， 用紫外分光光度计测定其A260/A280比值及含量， 用MOPS甲醛变性凝胶电泳观察完整性。

　　1.2.2 cDNA 合成 按Stratagene公司试剂盒说明书进行。取5 μg 纯化的mRNA样品作为模板， 用50个碱基的寡聚核苷酸为合成引物， 序列为5′GAGAGAGAGAGAGAGAGAGA ACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′（下划线处为Xho I 酶切位点）， 加逆转录酶StrataScriptRT（MMLV）， 混匀后42℃水浴1 h， 逆转录合成 cDNA第1链。置换法用RNaseH将mRNA降解成小片段作为引物合成 cDNA 第2链。合成的 cDNA第1链取5 μL， 第2链取1 μL用于电泳观察片段大小。双链合成后经 Pfu DNA聚合酶将链末端补平， 末端补平的cDNA上下游与EcoRⅠ适配子接头连接， 再将EcoRⅠ适配子的5′末端磷酸化， 用XhoⅠ酶切消化， 生成的cDNA分子一端带有Xho I黏性末端， 另一端带有EcoR I黏性末端。此cDNA产物经Sepharose CL2B层析柱按分子大小分离并分部收集， 共收集15管， 分别合并第6、 7、 8管和第9、 10、 11管， 合并后的两管各取8 μL经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳观察cDNA 产物片段大小。收集大于400 bp的片段并混匀， 乙醇共沉淀后溶于3.5 μL去离子水中， 取2.5 μL (100 ng) 的cDNA在T4 DNA连接酶的作用下与1 μg的ZAP Express载体进行连接， 载体预先用EcoRⅠ和XhoⅠ处理过。按Stratagene 公司包装试剂盒说明进行包装反应: 从-80℃取出包装蛋白， 融化后加入连接产物， 22℃水浴 2 h。反应结束加入500 μL噬菌体稀释液和 20 μL氯仿， 混匀离心， 上层液即为 cDNA 原始文库， 4℃保存。取1 μL原库液做梯度稀释， 与200 μL的 XL1Blue MRF′菌株混合， 铺板， 计数蓝白色斑， 测定文库滴度及重组率。

　　1.2.3 cDNA 文库的扩增及质量鉴定 按每个150 mm平板生长5×104个克隆数计算， 取适量原始文库液与 XL1Blue MRF′菌株混合， 铺板。37℃孵育， 噬斑长至约1～ 2 mm， 给每个平板内加入10 mL SM 液， 4℃过夜。再放置摇床缓慢摇动1 h， 以洗脱噬菌体。收集洗脱液， 加入终浓度为50 mL/L的氯仿， 混匀， 离心取上清， 即为cDNA扩增文库。加入终浓度为3 mL/L的氯仿和70 mL/L的二甲基亚砜（DMSO）， -80℃保存。取1 μL扩增文库按梯度稀释， 铺板， 测定扩增文库滴度。同时， 随机挑取8个白色噬菌斑， 分别置于 20 μL SM 液中4℃过夜。各吸取1 μL 进行PCR反应， 以扩增插入片段。在50 μL反应体系中加入灭菌去离子水37 μL， 10×Advantage2PCRbuffer 5 μL， dNTP mix 2.0 μL， T3、 T7 引物各2 μL， Taq DNA 聚合酶1 μL。PCR反应参数: 94℃预变性1 min， 94℃ 30 s， 51℃ 30 s， 72℃ 4 min， 30个循环， 72℃ 10 min。取5 μL扩增产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析， 鉴定插入的 cDNA 片段大小。

　　2 结果

　　2.1 总RNA的提取和mRNA的分离纯化 总RNA经紫外分光光度计测A260/A280为1.87， 经MOPS甲醛变性凝胶电泳观察， 28 S和18 S条带清晰， 亮度比例恰当， 说明总 RNA 未被降解(图1)。mRNA紫外分光光度计测A260/A280为2.02， 表明mRNA纯度高， 符合构建文库要求。

　　图1 人大肠癌细胞系CCL187和CX1细胞总RNA（略）

　　Fig 1 Electrophoresis result of colorectal cancer cell lines CCL187 and CX1 total RNA

　　M: DL 2 000 marker; 1: Total RNA.

　　2.2 cDNA第 1、 2 链的合成及鉴定 合成的 cDNA第1、 2链琼脂糖凝胶电泳结果表明， cDNA的第 1 链片段集中区在1.0～2.0 kb之间; 第2链与第1链相似 ， 为连续拖影smear， 大小分布均匀， 符合实验要求（图2）。
　　
　　将所合成的cDNA通过SepharoseCL2B柱层析分离， 分步收集后， 分别合并第 6、 7、 8管和第9、 10、 11管， 并取小量体积电泳 (图3)， 结果显示， 在所收集的第6、 7、 8管中的cDNA大小在500 bp以上， 符合 cDNA文库构建的要求。

　　图2 cDNA第1链和第2链合成情况的电泳分析（略）

　　Fig 2 Electrophoresis analysis of firststrand and secondstrand of cDNA

　　M: DL 2 000 marker; 1: Firststrand cDNA; 2: Secondstrand cDNA.

　　图3 过柱分离所收集cDNA 样品的电泳分析（略）

　　Fig 3 Electrophoresis analysis of collected cDNA samples after column chromatograph

　　M: DL 2 000 marker; 1: Collected cDNA fractions (6-8 tubes); 2: Collected cDNA fractions (9-11 tubes).

　　2.3 cDNA表达文库的鉴定 经测定原始文库容量为2.3 ×109 pfu/L。在涂有 Xgal、 IPTG 的平板上进行蓝/白斑筛选， 测定文库重组率约为97%。原始文库经扩增后， 测定滴度为1.2×1012 pfu/L。

　　2.4 cDNA表达文库插入片段的PCR分析 随机挑取8个克隆经PCR鉴定cDNA插入片段大小。10 g/L琼脂糖电泳结果显示， 插入片段长度平均达1.0 kb 以上 (图4）。

　　图4 PCR扩增cDNA表达文库插入片段（略）

　　Fig 4 PCR amplification of inserted fragments of cDNA library

　　M: DL 2 000 marker; 1-8: The PCR products of the clones picked randomly from the cDNA library.

　　3 讨论
　　
　　cDNA文库的质量主要反映在文库的代表性和重组cDNA片段的序列完整性两个方面。文库的代表性可用库容量来衡量。根据以往文献报道用抗体或血清筛选cDNA文库， 所构建的cDNA文库至少需含106以上的重组子， 重组率&>90%。我们选取2株人大肠癌细胞建库， 有着相对单一的转录本库， 比新鲜肿瘤标本更具有代表性。构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库原始文库容量为2.3×109 pfu/L， 重组率约为97%， 完全达到这一标准。
　　
　　本研究选用的 Stratagene公司试剂盒在合成cDNA第1链时， 所用的反转录酶StrataScript RT是由鼠源反转录酶(MMLVRT)经基因工程改造而来， 无RNaseH活性。它较未改造的酶在合成cDNA第1链时产量更高， 全长cDNA的比例也显著增加。在 cDNA第 2链合成的过程中采用的是置换合成法， 利用RNaseH在杂交链的mRNA链上造成缺口， 从而产生一系列RNA引物， 使之成为合成第2链的引物， 在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第 2链。这一做法的优点是可以使第1链 的反应产物不须进一步处理或纯化就可直接用于第2链的合成。而且不需要使用 核酸酶切割双链S1 cDNA的单链发卡环。另外也避免了在 PCR扩增过程中因扩增效率的不同所带来的 mRNA原始丰度的变化， 这对于一些较低拷贝数基因的克隆具有优势， 也是我们选择该方法的主要原因。本研究所选用的噬菌体 ZAP Express 载体， 是一个插入型载体， 既可在真核细胞表达， 又可在原核细胞表达; 在其质粒序列内有一多克隆位点， 进入宿主菌后其质粒部分可从载体上切下， 形成质粒载体。这个质粒载体多克隆位点两侧有T7和T3启动子， 有利于DNA序列分析， RNA 序列分析和 RNA 探针合成。该载体携带着存在于编码β半乳糖苷α互补片段的lacZ基因区域内的多克隆位点， 长至10 kb的 cDNA 都可以插入 lacZ 启动子下游的多克隆位点内。目的基因可定向插入位于载体多克隆位点内的EcoRⅠ和 XhoⅠ内切酶位点之间。
　　
　　重组子插入片段的大小也是评价文库质量的重要标准。插入片段的大小与条件有关， 片段太短则文库质量不高。另外， lacZ 基因突变也可产生非重组的白色噬菌斑。因此我们随机挑取8个白斑， 经PCR反应直接分离插入的cDNA。结果显示， 所有白斑均有插入片段， 大小0.5 kb～3.0 kb， 平均超过1.0 kb， 完全符合质量要求。
　　
　　体内外一系列实验显示， ND1 mAb特异性强， 亲和力高， 并优于目前广泛采用的美国商业产品抗cEA mAb［5］。因此， 成功构建人大肠癌抗原基因的 cDNA噬菌体表达文库为寻找特异性抗原， 并为应用于临床大肠癌早期诊断及治疗奠定了基础。

参考文献

　　［1］ Smith RA， Cokkinides V， Epre HL. American cancer society guidelines for the early detection of cancer［J］. CA Cancer J Clin， 2004， 54(1): 41- 52.

　　［2］ Bleday R， Song J， Walker ES， et al. Characterization of a new monoclonal antibody to a cell surface antigen on colorectal cancer and fetal gut tissues［J］. Cancer， 1986， 57(3): 433-440.

　　［3］ Line A， Slucka Z， Stengrevics A， et al. Characterization of tumour associated antigens in colon cancer［J］. Cancer Immunol Immunother， 2002， 51(10): 574-582.

　　［4］ Santegoets SJ， Schreurs MW， Reurs AW， et al. Identification and characterization of ErbB3binding protein1 as a target for immunotherapy［J］. J Immuno， 2007， 179(3): 2005-2012.

　　［5］ 莫志成， 宋今丹. 肿瘤相关抗原LEA与CEA在大肠癌表达的对比研究［J］. 中国肿瘤临床1999， 26(7): 511-513.