微波辐射对PC12细胞突触素I表达的影响及其机制

【摘要】 目的: 探讨微波辐射对PC12细胞突触素I表达及其磷酸化水平的影响， 并通过对其相关影响因子BDNF及其受体TrkB改变的探讨， 初步揭示突触素I改变的机制。方法: 采用30 mW/cm2微波辐射PC12细胞， 于辐射后1 h， 通过HPLC检测氨基酸递质释放的改变; 于辐射后3 h、 9 h、 1 d和2 d， 通过RTPCR、 Western blot和免疫细胞化学检测突触素I， BDNF和TrkB表达以及突触素I磷酸化的改变; 通过免疫共沉淀检测BDNF和TrkB相互作用的改变。结果: 30mW/cm2微波辐射后1h， PC12细胞释放的Asp、 Glu、 GABA和Gly均减少（P&<0.01）; 突触素ⅠmRNA于辐射后3～9 h减少， 1 d增加（P&<0.01或P&<0.05）， 2 d基本恢复; 其蛋白于辐射后9 h～2 d减少（P&<0.01或P&<0.05）; 磷酸化的突触素Ⅰ在辐射后3～9 h减少， 1 d增加， 2 d又见减少（P&<0.01或P&<0.05）。BDNF mRNA于辐射后3～9 h减少， 1 d增加， 2 d又见减少（P&<0.01或P&<0.05）; 其蛋白于辐射后3 h减少， 1～2 d又见增加（P&<0.05或P&<0.01）。TrkB mRNA在辐射后3 h和2 d减少; 其蛋白于辐射后3 h～1 d增加（P&<0.05或P&<0.01）， 2 d基本恢复。BDNF和TrkB的相互作用于辐射后3～9 h增强， 1～2 d减弱（P&<0.05或P&<0.01）。结论: 微波辐射可引起PC12细胞氨基酸递质释放障碍， 突触素Ⅰ表达及其磷酸化水平降低， BDNF和受体TrkB表达及其相互作用异常， 参与微波辐射所引起的PC12细胞信息传递障碍及其修复过程。

【关键词】 微波 PC12细胞 突触素I BDNF TrkB

　　突触传递在突触可塑性中发挥重要作用， 大多神经递质和神经活性物质储存在突触囊泡中， 通过胞吐作用释放出来。囊泡锚定过程是突触胞吐的始发阶段， 这个过程需要磷酸化依赖的突触素参与。脑源性神经生长因子(brainderived neurotrophic factor， BDNF)可通过作用于其受体TrkB激活Ras/MAPK信号通路， 影响突触素Ⅰ的表达和磷酸化[1]。由于原代神经元的培养条件要求较高， 且细胞数量有限， 在基因水平干预较难操作， 故在实验研究中受到很大的限制。PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系， 在神经生长因子(nerve growth factor， NGF)诱导后作为较成熟的神经细胞培养模型， 已被广泛应用于神经细胞分化、 离子通道、 受体、 递质释放、 神经毒性等的研究[2]。因此本实验中以PC12细胞为模型， 对微波辐射后氨基酸递质释放、 突触素Ⅰ及其磷酸化水平、 BDNF及其受体TrkB的改变进行探讨， 为阐明微波辐射致突触传递改变的机制奠定实验基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 PC12细胞购自中国科学院细胞生物研究所细胞库， 由本室传代保存; DMEM培养基购自美国Invitrogen公司; 胎牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所; Asp、 Glu、 GABA和Gly购自美国Sigma公司; NGF、 兔抗突触素ⅠIgG和兔抗磷酸化的突触素ⅠIgG均购自美国Chemicon公司; 兔抗TrkB IgG购自武汉博士德生物工程有限公司; 兔抗BDNF IgG、 生物素化羊抗兔IgG、 HRP链亲和素和DAB均购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 蛋白A琼脂糖购自美国Santa crutz公司; 用于BDNF、 TrkB、 突触素I和βactin PCR扩增的成对引物序列由北京奥科公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PC12细胞培养 复苏PC12细胞， 传3代后， 采用0.05 mg/L NGF， 10 mL/L胎牛血清的DMEM诱导其分化， 7～14 d后可见其有明显突起长出， 用于下一步实验。

　　1.2.2 辐射方法 PC12细胞接种于35 mm培养皿中， 置于布满吸收材料的微波室内， 放在辐射台上接受辐射， 平均功率密度为30 mW/cm2， 辐射时间为5 min。假辐射组仅放置于辐射台上5 min， 不给予辐射。

　　1.2.3 高效液相色谱仪检测PC12细胞氨基酸递质释放 辐射后1 h， 收集细胞， 1000 r/mim离心10 min， 取上清; 加入100 g/L磺基水杨酸， 5000 r/min离心15 min; 取上清， 加入2 mol/L KHCO3， 5000 r/min离心15 min; 取上清， 4℃保存。用高效液相色谱仪检测神经递质， 100 μL衍生试剂内加入20 μL 样品， 振荡2 min， 进样针加样20 μL。数据处理: 测得的数据为被测氨基酸所占的峰面积（A样）。根据标准品峰面积（A标）和浓度（C标）比， 可计算出被测氨基酸的浓度（C样）: C样(mg/L)=C标×A样/A标。

　　1.2.4 RTPCR法检测 PC12细胞BDNF、 TrkB和突触素I mRNA BDNF: 上游引物为TTACCTGGATGCCGCAAACA， 下游引物为GGCCCGAACATACGATTGG; TrkB: 上游引物为TGGGACGTTGGGAATTTGGTT， 下游引物为CAGCCGTGGTACTCCGTGTG; 突触素Ⅰ: 上游引物为CTGCTGGTCCCATTCGTCAG， 下游引物为GCTGGCGAAAGACTTCCTCAG; βactin: 上游引物为CTGTGCCCATCTATGAGGGTTAC， 下游引物为AATCCACACAGAGTACTTGCGCT。于辐射后3 h、 6 h、 9 h、 1 d 和2 d收集细胞， 参照TRIzol试剂说明书方法提取总RNA， 其A260/280在1.7～2.0之间。各组各时间点RNA提取物每1.5 μg中加入OligoP(dT)18 Primer 0.5 μL， 无RNA酶的水补充至6 μL， 70℃ 5 min; 再加入5×反应液2 μL， RNA酶抑制剂0.5 μL和dNTP 混合物1 μL， 37℃水浴5 min后加入0.5 μL AMVRT， 42℃ 60 min; 之后70℃反应10 min， 4℃或冷冻保存。以βactin为内参照进行PCR， 突触素I cDNA扩增条件为94℃ 3 min， 94℃ 30 s， 57℃ 45s（BDNF 55℃ 45 s; TrkB 56℃ 30 s; βactin 54℃ 30 s）， 72℃ 45 s， 72℃ 5 min; 均为25个循环。取5 μL PCR产物与1 μL DNA上样缓冲液混匀后在10 g/L的凝胶上电泳， 用凝胶成像系统扫描分析。

　　1.2.5 免疫细胞化学和Western blot方法检测PC12细胞BDNF、 TrkB、 突触素Ⅰ以及磷酸化的突触素Ⅰ 免疫细胞化学检测: 辐射后3 h、 9 h、 1 d和2 d制作细胞爬片， 甲醇/丙酮 (1∶1) 固定10 min， 4℃保存; 细胞爬片复温; 0.1 mol/L PBS洗涤3×3 min; 30 mL/L h3O2室温孵育10 min; 0.1 mol/L PBS洗涤3×3 min; 1 g/L胰酶抗原修复5 min; 0.1 mol/L PBS洗涤3×3 min; 血清封闭10 min; 加适当比例稀释的一抗， 37℃ 1 h， 4℃过夜; 0.1 mol/L PBS洗涤3×3 min; 加生物素化的羊抗兔IgG（1∶200）， 37℃ 50 min; 0.1 mol/L PBS洗涤3×3 min; 加HRP链亲和素（1∶200）， 37℃ 50 min; 0.1 mol/L PBS洗涤3×3 min; DAB显色， 镜下控制显色效果， 充分水洗、 脱水、 透明和封片。选用PBS作为一、 二和三抗的阴性对照。在光镜10×40倍视野下， 应用CMIASⅡ图像分析仪对BDNF和TrkB的免疫细胞化学结果进行积分光密度（integral optical density， IOD）和平均光密度（mean optical density， MOD）测定。Western blot检测， 于辐射后3 h、 9 h、 1 d和2 d， 制备PC12细胞总蛋白后， 测定蛋白浓度， 上样， 电泳， 转膜， 用PBST清洗PVDF膜， 100 g/L脱脂奶粉常温封闭3 h; 加兔抗突触素I多抗或兔抗磷酸化的突触素I多抗（含100 g/L脱脂奶粉的PBST稀释1∶1000）， 4℃过夜， PBST清洗 3×10 min; 加入生物素标记的羊抗兔IgG (PBST液1∶2000 稀释)， 常温1 h， PBST清洗3×10 min; 采用发光底物试剂盒显影。将目的条带扫描后应用CMIASⅡ图像分析仪， 测目的条带的IOD值， 将扫描值与βactin扫描值相比， 然后以样本/内参照的比值表示突触素I/磷酸化的突触素I的表达水平。

　　1.2.6 免疫共沉淀方法检测PC12细胞BDNF和TrkB相互作用 于辐射后3 h、 9 h、 1 d和2 d， 取300 μg PC12细胞蛋白加裂解液补足至250 mL; 加5 mL兔抗BDNF多抗， 摇床4℃震摇1 h; 加20 μL蛋白A琼脂糖， 4℃摇过夜; 2500 r/min离心5 min; 弃上清， 收取琼脂糖沉淀; 加入冰浴裂解液洗4次， 离心取沉淀; 加入20 μL裂解液及20 μL上样缓冲液; 100℃水浴3 min， 4000 r/min离心10 min， 使琼脂糖沉淀， 取上清; 进行Western blot分析， 一抗加兔抗TrkB多抗(含100 g/L 脱脂奶粉的PBST稀释1∶1000)。显影后， 将目的条带扫描后应用CMIASⅡ图像分析仪， 测目的条带的IOD值。

　　1.2.7 统计学分析 文中数据以均数和标准差（x±s）表示， 采用SAS软件进行单因素方差分析， P&<0.05者具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 PC12细胞氨基酸递质释放的改变 30 mW/cm2辐射后1 h PC12细胞释放的Asp、 Glu、 GABA和Gly均减少（表1）。表明30 mW/cm2辐射后PC12细胞间信息传递受抑制。

　　表1 微波辐射后1 h PC12细胞氨基酸递质释放的改变（略）

　　Tab 1 Change of the release of amino acids in PC12 cells at 1 h after microwave radiation（略）

　　bP&<0.01 vs control group.

　　2.2 PC12细胞突触素Ⅰ和磷酸化的突触素Ⅰ表达的改变 (1)突触素ⅠmRNA的改变: 30 mW/cm2辐射后3～9 h见突触素ⅠmRNA减少， 1 d增加， 2 d基本恢复（图1）， 提示微波辐射后PC12细胞突触素Ⅰ转录存在异常。(2)突触素Ⅰ和磷酸化的突触素Ⅰ表达的改变: 30 mW/cm2辐射后9 h～2 d突触素Ⅰ表达减少， 但有恢复趋势; 磷酸化的突触素Ⅰ表达在辐射后3～9 h减少， 1 d增加， 2 d又见减少（图2和表2）; 提示微波辐射后PC12细胞的囊泡锚定存在障碍。

　　图1 微波辐射后PC12细胞突触素ⅠmRNA的变化（略）

　　Fig 1 Change of synapsin I mRNA in PC12 cells after microwave radiation

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs control group.

　　图2 微波辐射后PC12细胞突触素Ⅰ和磷酸化突触素Ⅰ表达的变化（略）

　　Fig 2 Change of synapsin I and its phosphorylation expression in PC12 cells after microwave radiation

　　A， B: Expression of synapsin I and its phosphorylationrespectively; C: Expression of actin. 1: Control; 2-5: 3 h， 9 h， 1 d and 2 d after 30 mW/cm2 radiation， respectively.

　　表2 微波辐射后PC12细胞突触素Ⅰ和磷酸化突触素Ⅰ表达改变的定量分析结果（略）

　　Tab 2 Quantitative analysis of synapsin I and its phosphorylation expression in PC12 cells after microwave radiation

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs control group.

　　2.3 PC12细胞BDNF的改变 (1) BDNF mRNA: 30 mW/cm2辐射后3～9 h BDNF mRNA减少， 1 d增加， 2 d又见减少（图3）， 表明微波辐射后PC12细胞BDNF转录减少。(2) BDNF蛋白: 阴性对照结果为阴性。假辐射组PC12细胞质BDNF呈棕黄色阳性表达(图4A)。30 mW/cm2辐射后3 h， PC12细胞质内BDNF表达减少; 9 h后增加(图4B)， 2 d基本恢复。其定量分析结果同上(表3)。

　　图3 微波辐射后PC12细胞BDNF mRNA的变化（略）

　　Fig 3 Change of BDNF mRNA in PC12 cells after microwave radiation

　　bP&<0.01 vs control group.

　　表3 微波辐射后PC12细胞BDNF表达的定量分析结果（略）

　　Tab 3 Quantitative analysis of BDNF expression in PC12 cells after microwave radiation

　　bP&<0.01 vs control group.

　　2.4 PC12细胞TrkB的改变 (1)TrkB mRNA: 30 mW/cm2辐射后3～9 h TrkB mRNA减少， 1 d恢复， 2 d又见减少（图5）， 表明微波辐射后PC12细胞TrkB转录减少。(2) TrkB蛋白: 阴性对照结果为阴性， 假辐射组PC12细胞质TrkB呈棕黄色(图6A)。30 mW/cm2辐射后9 h TrkB表达有所增加(图6B)， 2 d仍未恢复。其定量分析结果同上(表4)。

　　图4 PC12细胞中BDNF的表达（略）

　　Fig 4 The expression of BDNF in PC12 cells (LSAB， ×420)

　　A: Control， BDNF was positive in the cytoplasm of PC12 cells; B: BDNF was increased at the ninth hour after microwave radiation.

　　图5 微波辐射后PC12细胞TrkB mRNA的改变（略）

　　Fig 5 Change of TrkB mRNA in PC12 cells after microwave radiation

　　bP&<0.01 vs control group.

　　图6 PC12细胞中TrkB的表达（略）

　　Fig 6 The expression of TrkB in PC12 cells (LSAB， ×420)

　　A: Control， TrkB was positive in the cytoplasm of PC12 cells; B: TrkB was increased at the ninth hour after microwave radiation.

　　表4 微波辐射后PC12细胞TrkB表达的定量分析结果（略）

　　Tab 4 Quantitative analysis of TrkB expression in PC12 cellsafter microwave radiation

　　bP&<0.01 vs control group.

　　2.5 BDNF和TrkB相互作用的改变 30 mW/cm2辐射后3～9 h BDNF和TrkB相互作用增强， 但1 d后减弱， 2 d仍未恢复（图7）。表明微波辐射PC12细胞后， BDNF与其受体TrkB结合量减少， 可能进一步影响微波辐射后脑损伤的恢复过程。

　　图7 微波辐射后PC12细胞BDNF和TrkB相互作用的改变（略）

　　Fig 7 Change of interaction between BDNF and TrkB in PC12 cells after microwave radiation

　　1: Control; 2-5: 3 h， 9 h， 1 d and 2 d after 30 mW/cm2 radiation， respectively. aP&<0.05， bP&<0.01 vs control group.

　　3 讨论
　　
　　突触前结构中， 大多神经递质和神经活性物质储存在突触囊泡中， 通过胞吐作用释放出来。在胞吐过程中， 突触囊泡锚定在突触前末端的活性区， 需要磷酸化依赖的突触素的参与， 且锚定过程是突触胞吐发挥作用的始发阶段， 该过程能否启动， 直接影响到囊泡胞吐全过程的继续。由于体内环境影响因素较多， 为了深入探讨突触素Ⅰ在微波辐射致突触传递改变中的作用， 我们选用NGF诱导后的PC12细胞为体外模型。PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系， 在NGF作用下分化为神经元样细胞: 细胞停止增殖; 形成神经突起和突触样连接; 出现神经细胞特有的细胞膜电位[2， 3]。微波辐射对PC12细胞的影响报道少见， 杨学森等[4， 5]采用未经NGF诱导PC12细胞发现， 65 mW/cm2电磁波辐射20 min可引起PC12细胞损伤（细胞存活率明显降低， 乳酸脱氢酶释放率增加， 细胞凋亡率增加）， 激活MAPK信号转导系统， 其中ERK1/2、 JNK、 P38MAPK表现为差别激活。
　　
　　本研究中， 30 mW/cm2辐射后6 h， PC12细胞释放的四种氨基酸递质减少， 提示囊泡胞吐存在障碍或递质合成减少。为了揭示递质释放障碍的原因， 本研究以突触素Ⅰ为靶点， 对其表达和磷酸化的改变以及相关影响因素BDNF进行了深入探讨。突触素一方面通过对突触结构的影响[6]， 另一方面通过其磷酸化作用调节神经递质的释放[7， 8]， 从而在突触可塑性中起一定作用。微波辐射后突触素表达和磷酸化的改变未见报道。本实验显示30 mW/cm2微波辐射后突触素ⅠmRNA、 蛋白及磷酸化水平均减少， 且蛋白改变晚于基因改变。磷酸化的突触素Ⅰ改变早于突触素Ⅰ， 因为突触素Ⅰ主要以磷酸化的形式发挥作用， 故磷酸化的突触素Ⅰ在辐射早期即见减少， 可能正是递质释放障碍的原因之一。BDNF作用于其受体TrkB激活Ras/MAPK信号通路， 影响突触素Ⅰ的磷酸化及其表达[1， 9]， 进一步影响Glu和GABA的释放; 也可增加CREB和突触素Ⅰ的mRNA水平[10， 11]。本研究发现， 30 mW/cm2微波辐射后BDNF mRNA呈减少增加减少的改变; 蛋白先减少后增加。由于mRNA改变一般早于蛋白改变， 故蛋白1～2 d增加与mRNA改变基本一致; 但2 d时mRNA减少， 可能引起2 d后蛋白进一步的减少。微波辐射后TrkB mRNA减少， 蛋白增加， 可见蛋白和mRNA改变并不一致; 但为何mRNA的减少未引起蛋白的减少， 原因并不明确， 可能与BDNF减少后， TrkB反应性的升高， 随之其合成受限有关。BDNF和TrkB的相互作用在微波辐射后先增强后减弱， 相互作用增强是细胞的一种保护性反应， 对细胞损伤进行恢复性调节; 但之后减弱， 表明细胞存在损伤， 可能在二者表达都增加（2 d）后， 相互作用也会有所恢复。BDNF和TrkB相互作用减弱可能引发突触素Ⅰ表达和磷酸化的减弱， 1 d时突触素ⅠmRNA及其磷酸化水平的波动性变化可能与BDNF的保护性作用有关。BDNF可能与减慢微波辐射后PC12细胞的损伤并促进其修复有关。
　　
　　总之， 微波辐射可引起PC12细胞氨基酸递质释放障碍， 突触素Ⅰ表达及其磷酸化水平降低， BDNF和受体TrkB表达及其相互作用异常， 参与了微波辐射所引起的PC12细胞信息传递障碍及其修复过程。

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