乌司他丁对心肺复苏大鼠心功能及心肌组织CD11b、 ICAM1的影响

【摘要】 　　目的：观察心肺复苏后大鼠心功能和心肌组织黏附因子CD11b、细胞间黏附分子1（ICAM1）水平及心肌细胞超微结构的变化，以及乌司他丁对其的影响。方法: 利用窒息法制造心脏骤停大鼠模型，将Sprague Dawley大鼠随机分为对照组、复苏组及乌司他丁组，每组9只。于自主循环恢复(ROSC ) 2 h，测定左室收缩压(LVSP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室压力上升、下降最大速率(dp/dtmax)，采用透射电镜（TEM）观察心肌细胞超微结构变化，ELISA法测定心肌组织CD11b、ICAM1水平。结果: 与复苏组比较，乌司他丁组心功能有所改善，心肌组织病变减轻，CD11b、ICAM1水平显著下降。结论: 乌司他丁可抑制黏附因子CD11b和ICAM1表达，改善心肺复苏后大鼠心功能，减轻心肌细胞损伤。

【关键词】 心肺复苏；CD11b；ICAM1；乌司他丁

　　［ABSTRACT］ Objective: To observe a few indicators of rats after cardiopulmonary resuscitation (CPR)， including the changes in heart function， CD11b and intercellular adhesive molecule1 (ICAM1) levels of myocardial tissue，ultrastructural changes of cells， as well as the impact of urlinastatin (UTI) on these indicators. Methods: Sprague Dawley rats were randomly pided into three groups: control group， resuscitation group and UTI group， with 9 rats in each group. Cardiac arrest was induced by performing asphyxiation to groups except A and CPR was performed then. Two hours after recovery， tested left ventricle systolic pressure (LVSP)， left ventricle enddiastolic pressure (LVEDP)， maximum rate of increase and decrease in left ventricular pressure (±dp/dt). The level of CD11b， ICAM1 in myocardial tissue was determined by the ELISA method， The ultrastntctural damages were observed with transmission electron mictnscope(TEM ). Results: Compared with resuscitation group， heart function in UTI group were improved. The damage of myocardial ultrastructure was ameliorated markedly. The levels of CD11b and ICAM1 in the UTI group were significantly lower than those in the resuscitation group. Conclusion: UTI can improve myocardial function， inhibits the exhibition of CD11b and ICAM1， and alleviate the myocardial injury.

　　［KEY WORDS］ Cardiopulmonary resuscitation; CD11b; ICAM1; Ulinastatin

　　心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation， CPR)是针对心跳骤停所采取的抢救措施，它的实施挽救了许多病人的生命，但目前心肺复苏成功率仍然很低。一项对778例复苏患者进行的研究结果显示，65%的患者在复苏后1周内死亡，超过半数死于复苏后心肌功能不全，表现为明显的低血压、休克及再发心跳骤停等［1］。目前认为，严重的心肌缺血/再灌注损伤是导致复苏后心功能不全的主要因素。其中，缺血再灌注后心肌组织过度的炎症反应是造成再灌注损伤的重要原因之一，而黏附分子的高度表达是炎症反应发生的始动环节［2］。如何减轻炎症反应，减少心肌组织的再灌注损伤，成为心肺复苏后心功能障碍治疗的新思路和方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及CPR模型的制备
　　
　　健康成年Sprague Dawley大鼠27只随机分为对照组、复苏组与乌苏他丁组，按有关文献［3］采用夹闭气管窒息法建立大鼠心搏骤停模型。术前禁食不禁水12h，用3‰戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，颈部正中切口，气管插管，监测心电图。分离并在左侧颈外静脉置管、固定。分离右侧颈总动脉，远心端用线结扎，细塑料管充满盐水和肝素250μg/L插入，并通过压力感受器与PC Lab软件相连，稳定5min后，将塑料管进一步插入左心室，测定血流动力学及心功能，包括左室收缩压(LVSP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室压力上升、下降最大速率(dp/dtmax)，同步记录心率( HR)。复苏组、乌司他丁组插管后稳定10min，于呼气末夹闭气管导管使大鼠窒息，7～9min后，以大鼠心室内压≤30mmHg、波形成直线为判断心脏停搏的标志，开始复苏。打开气管夹闭钳，机械通气，设置吸入氧浓度100%、通气频率60次/min、潮气量6mL/kg，静脉注射肾上腺素0.02mg/kg，同时进行人工胸外心脏按压，按压频率250～300次/min，按压深度为大鼠胸廓前后径的1/3。必要时重复给药，出现室颤时予以电除颤 (3，5，10J/kg) 。　　

　　当大鼠出现自主心律、脉搏波，收缩压≥60mmHg并持续10min以上判定为自主循环恢复(ROSC)，乌司他丁组给予乌司他丁5万U/kg缓慢静脉注射，复苏组静脉注射等量无菌生理盐水。对照组仅进行插管等手术操作，静脉注射生理盐水。连续监测大鼠的呼吸、心率及心电图，15min无效则放弃复苏。于ROSC2h后记录LVSP、LVEDP及dp/dtmax。

　　1.2 心肌组织CD11b及细胞间黏附分子1（ICAM1）测定
　　
　　模型制作完成后2h，开胸取大鼠心肌组织。以4℃等渗盐水冲洗除去血液，滤纸拭干称重。取心肌组织，加100mg/mL冰等渗盐水，制备成组织匀浆，2 000r/min离心5min，取上清液置-80℃保存，以ELISA法测定心肌组织CD11b水平，双抗体夹心ABCELISA法测定心肌组织ICAM1水平。

　　1.3 电镜检查
　　
　　每组随机选大鼠2只，ROSC2h 后心脏灌注生理盐水至血液变清，开胸取左心室壁心肌组织，用锐利刀片切成0.1cm×0.1cm 大小组织3块，放入2%多聚甲醛2.5%戊二醛电镜专用液中4℃ 固定2h，二甲砷酸钠缓冲液(pH=7.2)冲洗3次，每次10min，1% 锇酸4℃ 固定2h，梯度酒精脱水，环氧丙烷置换2次，各15min，环氧树脂Epon812包埋剂包埋，包埋块修整，超薄切片，醋酸双氧铀/枸橼酸铅染色，Philip EM 208s透射电镜下观察。

　　1.4 统计学处理
　　
　　采用SPSS11.5统计软件包进行处理。对各组数据先进行正态性检验，计量资料均用均数±标准差(±s)表示，两组间均数比较采用t检验，3组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验法和LSD法。P &< 0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 心功能变化
　　
　　ROSC2h后，复苏组LVSP较对照组明显降低(P&<0.05)， LVEDP较对照组明显升高(P&<0.05);乌司他丁组LVSP较对照组略有降低，差异无统计学意义（P&> 0.05），LVEDP较对照组升高，差异有统计学意义(P &< 0.05)；乌司他丁组LVSP较复苏组有升高，但差异无统计学意义（P&> 0.05）， LVEDP在ROSC 2 h时较复苏组明显降低(P &< 0.05)；复苏组及乌司他丁组±dp/dtmax均明显低于对照组，差异有统计学意义(P &< 0.05)，乌司他丁组±dp/dtmax较复苏组均升高，但差异无统计学意义（P&> 0.05）（表1）。 表1 ROSC2h后3组大鼠心功能、CD11b、ICAM1的变化（略） 注：与对照组比较，*P&<0.05；与复苏组比较， △P&<0.05。

　　2.2 心肌组织CD11b、ICAM1变化

　　ROSC2h复苏组CD11b较对照组明显升高，差异有统计学意义（P&<0.05）；乌司他丁组CD11b含量较复苏组显著减少（P&<0.01），乌司他丁组CD11b水平较对照组减少，但差异无统计学意义（P&>0.05）。
　　 复苏组ICAM1水平较对照组上升，差异有统计学意义（P&<0.05）；乌司他丁组ICAM1水平较对照组及复苏组均明显下降，差异有统计学意义（P&<0.05）（表1）。

　　2.3 电镜结果
　　
　　对照组心肌细胞结构正常，线粒体无肿胀，嵴排列整齐，心肌纤维排列规则（图1a)；复苏组可见心肌细胞部分线粒体增生，外膜不完整，线粒体嵴模糊不清，有肿胀，可见线粒体空泡样变(图1b)；乌司他丁组心肌细胞线粒体增生明显，嵴结构正常，细胞核正常(图1c)。

　　2.4 相关性分析
　　
　　心肌组织CD11b和LVEDP呈正相关（r=0.934，P&<0.01），与LVSP呈负相关（r=-0.930，P&<0.05）；ICAM1与LVEDP呈正相关（r=0.711，P&<0.05），与LVSP呈负相关（r=-0.968，P&<0.05）。

　　3 讨论
　　
　　CPR是针对呼吸心跳停止所采取的抢救措施，但复苏后再灌注常造成多器官功能损害，尤其是心功能障碍。其原因为呼吸心跳骤停，引起心肌组织严重缺血缺氧，而CPR使自主循环恢复后，心肌组织又遭受再灌注所致的打击，导致心脏功能障碍，甚至心衰，导致患者死亡。近年来研究结果表明，心肌缺血再灌注后过度的炎症反应是造成再灌注损伤的重要机制之一，而黏附分子CD11b与ICAM1的高度表达导致了中性粒细胞、单核细胞与血管内皮细胞的紧密黏附［4］，并介导了中性粒细胞、单核细胞穿过内皮细胞层浸润到心肌组织释放氧自由基等毒性产物，破坏性蛋白酶，引起心肌损伤［5］、心功能不全。所以，缺血再灌注后CD11b与ICAM1的水平与心脏功能障碍有着紧密联系，是诊断心脏功能障碍的重要指标。
　　
　　本实验结果显示心跳骤停大鼠CPR恢复自主循环后2h，反映心肌收缩功能的LVSP 下降，而反映心肌舒张功能LVEDP明显升高，±dp/dtmax明显降低，说明复苏大鼠存在心肌收缩和舒张功能不全，这与王小东等［6］研究结果基本一致。
　　 电镜观察心肌细胞超微结构发现，复苏组大鼠存在细胞结构的损伤，而心肌细胞结构的完整性是心肌功能的基础，说明大鼠复苏后由于存在严重的心肌细胞损伤，进而导致了心功能的降低。
　　
　　本实验结果表明，心肺复苏ROSC后2 h，复苏组心肌组织CD11b、ICAM1水平较对照组显著增高，说明复苏后黏附分子表达明显升高。而LVSP与CD11b、ICAM1水平呈负相关， LVEDP和CD11b、ICAM1水平呈正相关，也提示了CD11b和ICAM1水平的升高是复苏后心功能不全的一个重要因素。
　　
　　CD11b属于黏附分子β2整合素亚家族成员，正常情况下仅在单核细胞和中性粒细胞膜上呈低水平表达。而在病理情况下，CD11b表达增加，并通过与其配体内皮细胞表达的细胞黏附分子ICAM1相互作用而介导中性粒细胞与内皮细胞黏附，为炎症早期反应、血管损伤的关键步骤。缺血再灌注后，通过增加CD11b和ICAM1的表达，中性粒细胞与内皮细胞的粘附性增强，最终使大量中性粒细胞迁移到心肌血管周围组织［7］，并通过释放氧自由基、血小板活化因子、胶原酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶、蛋白水解酶及脂类代谢产物等造成心肌组织细胞损伤［8］，导致心功能不全。有文献显示，大鼠心肌缺氧30min后再复氧2h，ICAM1基因缺失型大鼠的心肌细胞释放的肌钙蛋白、CKMB、IDH明显较野生型大鼠减少，且心肌损伤评分和心肌梗塞面积状况同样具有上述特点［9］。
　　
　　乌司他丁是一种糖蛋白水解酶抑制剂，其分子中存在多种酶结合位点，为广谱酶抑制剂，具有清除自由基、稳定溶酶体膜及抑制炎性介质释放［10，11］、抑制蛋白质分解代谢亢进等药理作用。
　　
　　本实验结果表明，心肺复苏ROSC后2 h，乌司他丁能显著改善大鼠CPR后早期心脏舒张功能，保护心肌细胞线粒体结构，减轻心肌细胞损伤。本实验表明，乌司他丁可显著减低心肌组织中 CD11b、ICAM1含量，且CD11b、ICAM1含量与LVEDP水平呈正相关，这说明乌司他丁通过抑制黏附分子的表达，降低了以CD11b、ICAM1为介质引导的炎症反应，保护了心功能。范慧敏等［12］运用抑肽酶观察体外循环时心肌细胞上ICAM1的变化，实验结果表明抑肽酶可以抑制心肌细胞及心肌血管上内皮细胞ICAM1的表达，具有心肌保护作用。本实验结果也显示乌司他丁可以提高大鼠的LVSP水平及±dp/dtmax水平，但与复苏组比较无明显统计学意义，说明缺血再灌注导致心肌损伤的机制复杂，还存在很多其它影响因素，因此单一使用乌司他丁不能完全拮抗心功能障碍。
　　
　　综上所述，乌司他丁能通过抑制粘附分子CD11b、ICAM1的表达，减轻心肌细胞的损害进而保护心功能，但其对心脏的整体保护作用还有一定的局限性。

参考文献

　　1 Brain Resuscitation Clinical Trial II Study Group. A randomized clinical trial of calcium entry blacker ( lidoflazine ) in the treatment of comatose survivors of cardiac arrest ［J］. EngJ J Med，1991，324：12251231.

　　2 王长谦.细胞黏附分子与心肌缺血再灌注损伤［J］.国外医学生理病理科学与临床分册，1996，16(2):82.

　　3 陈寿权，李章平，王姗姗，等.窒息法致大鼠心脏骤停模型复苏的影响因素［J］.中国急诊医学杂志，2005，14(10)：814817.

　　4 张雪萍，刘新波，任永功，等.黏附分子CDllb与ICAM1在PMN跨内皮移行中的作用机制［J］. 华中科技大学学报（医学版)，2007，36（1）：9496.

　　5 吴弘，沈茜，郎希龙，等.细胞粘附分子在中性粒细胞介导的缺氧/复氧心肌细胞损伤中的作用［J］. 中国应用生理学杂志，2001，17（3）：227229.

　　6 王小东，李培杰，杨兰，等.乌司他丁对心肺复苏后兔心脏保护作用的实验研究［J］. 中国急救医学，2007， 27（5）：436439.

　　7 Furie MB，Mchugh DD.Migration of neutrophils across endothelial monolayers is stimulated by treatment of the monolayers with IL1 or TNFα［J］. Immunology，1989，143：3309.

　　8 诸冰雪，贾兵. 体外循环时心肌组织黏附分子的表达及抑肽酶对其的影响［J］.复旦学报(医学版)，2004， 31(3)：259262.

　　9 Metzler B， Mair J， Lercher A， et al. Mouse model of myocardial remodeling after ischemia: role of intercellular adhesion molecule1［J］. Cardiovasc Res，2001，49(2)：399407.

　　10 旷听，黄艳. 乌司他丁对体外循环心脏病人血浆TNFα、IL6和IL8的影响［J］. 中国医学工程， 2004，12(5)：2628.

　　11 季云秋.乌司他丁治疗急性脑梗死的临床研究［J］.实用临床医药杂志，2007，11(6): 6869.

　　12 范慧敏，李伦明，张凯伦，等.体外循环时心肌细胞上ICAM1的变化及抑肽酶对其表达的影响［J］. 同济医科大学学报，2001，30(3)：240224.