TGFβ1、TGFβR1、Smad4在乳腺癌发生、发展中的作用及其相互关系

　　　　 作者：夏立平，刘晓力，陈国平，郑武平，何冬雷，高炳玉

【摘要】 　　目的：探讨TGFβ1、TGFβR1及Smad4三者在乳腺癌中的表达与其发生、发展、转移等生物学行为以及预后的关系，为乳腺癌发病和治疗机制提供理论和实验依据。方法：提取30例乳腺癌临床标本（经液氮、研磨等处理）和MCF7、T47D、SKBR3三种乳腺癌细胞（取指数增长期细胞）总RNA，反转录cDNA第一链，克隆TGFβR1、Smad4基因片段，测定质粒浓度，制备标准样品，并作出标准曲线，探针法荧光定量PCR（FQPCR）检测TGFβR1和Smad4基因mRNA表达。结果：FQPCR检测发现恶性程度高的SKBR3细胞，其TGFβR1和Smad4的基因拷贝数明显低于恶性程度低的MCF7细胞（P均＜0.01），T47细胞两种基因拷贝数介于两者之间。结论：随着乳腺癌细胞病理类型恶性程度增加，TGFβR1和Smad4 mRNA表达逐步下降，表明TGFβ1和Smad4可能具有类似乳腺癌抑癌基因的作用。

【关键词】 转化生长因子β1; 转化生长因子β1受体; Smad4; 乳腺癌

　　［ABSTRACT］ Objective: To investigate the expression of TGFβ1， TGFβR1 and Amad4 proteins and the relationship to the initiation， progression， metaptosis and prognosis of breast cancer. Methods: The samples of 30 cases and 3 cell lines(MCF7，T47D，SKBR3) of breast cancer were selected， and the total mRNA was extracted. Reverse transcription， and TGFβR1 and Smad4 genes cloning were carried out. Then the concentration of plasmid was measured， standard curve was made， and the expression of TGFβR1 and Smad4 mRNAs were assayed by FQPCR machine. Results: The gene copies of TGFβR1 and Smad4 in SKBR3 cells were lower than that in MCF7 cells (P＜0.01) and the gene copies in T47 was middle. Conclusions: Our studies by FQPCR show that the lower TGFβR1 and Smad4 mRNAs expression， the worse biology characteristic of breast cancer， which indicate TGFβR1 and Smad4 act possibly as the role of antioncogene in breast cancer.
　　
　　［KEY WORDS］ TGFβ1; TGFβR1; Smad4; Breast cancer

　　乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，全世界每年约有120万妇女患乳腺癌。目前，乳腺癌病因尚不十分清楚，发病机理非常复杂，涉及多个因素的作用。多数研究认为，乳腺癌的发生是因为原癌基因的激活和抑癌基因的功能丧失，其发展是一个多因素多阶段的过程，往往涉及多个基因的改变［1，2］。TGF β /Smads信号传导通路及其与肿瘤关系多见于胰腺癌、妇科肿瘤等［3，4］，而在乳腺癌中TGFβ1、TGFβR1及Smad4三者的表达及其相互关系如何，它们对乳腺癌发生、发展有何意义，目前还不完全清楚。本实验拟采用荧光定量PCR (fluorescent quantitation polymerase chain reaction，FQPCR)、免疫组织化学/免疫细胞化学、Western Blotting等技术，检测乳腺癌患者和乳腺癌细胞株中的TGFβ1、TGFβR1和Smad4 在mRNA水平和蛋白水平表达，进一步深入三者在乳腺癌中的表达与其发生、发展、转移等生物学行为以及预后的关系，为探讨TGFβ信号转导过程提供新的思路，同时为乳腺癌的Smad4基因导入治疗，以及尝试应用iRNA技术，提供理论和实验依据

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 标本和细胞

　　本组乳腺癌临床标本共30例，全部为海南医学院附属医院2005年1月～2008年12月门诊或住院患者，其中外科手术切除标本25例，病理活检标本5例。患者年龄24～60岁，中位年龄43岁；按照病理学类型分为非浸润性癌4例、早期浸润性癌6及浸润性癌20例。
　　
　　乳腺癌细胞株MCF7、T47D、SKBR3细胞为本实验室保存。正常对照：选取非乳腺癌患者正常乳腺组织手术切除标本10例作为对照。

　　1.1.2 质粒和细菌

　　pGEMTTGFβR1 、pGEMTSmad4质粒构建按照pGEMT 载体试剂盒（公司）的说明。大肠杆菌DH5α为本实验室保存。

　　1.1.3 引物和探针

　　以Genebank中Smad4 和TGFβR1基因 的mRNA序列作参考，各设计一对引物和一条探针。⑴Smad4 上游引物(P1)：5′GTCGAAAACAACGCTATTGACT3′； 下游引物(P2)：5′CAGAGAATTGTCGCCGTACAT3′； 荧光探针：5′TCAGGACGCGATACCTCGGTATACC3′。 ⑵TGFβR1上游引物(P1)：5′GAACGACAACGATTCAACT3′； 下游引物（P2）：5′GCAACACGATCATGACTT3′； 荧光探针为5′TCTACGTAATAGCATGCGCCAAAT3′。
　　
　　探针5′端标记的荧光报告基团均为FAM，3′端标记的荧光淬灭基团均为TAMRA。引物及探针均由英俊公司合成。

　　1.1.4 主要试剂

　　RPMI1640培养基（GIBCO BRL公司）；无支原体胎牛血清（杭州四季青公司）；HEPES粉（ASBC进口分装）；PBS缓冲液（NaCl 8.0g， Na2HPO4·12h3O 3.63g， Kh3PO4 0.2g， pH7.4，自配）；胰蛋白酶（Sigma公司）；EDTA（公司）；TRIzol Reagent（Invitrogen公司）；DEPC（威佳公司）；氯仿（国产）；异丙醇（国产）；RT试剂盒（Fermentas公司）；Taq 酶（Progema公司）；DNA Marker（威佳公司）；Gel Estration Kit和小量质粒抽提试剂盒（QIAGEN公司）；PCR产物纯化试剂盒（博彩生物公司）。

　　1.1.5 仪器

　　二氧化碳孵箱（Hereaus B5060EK/CO2）； 倒置相差生物显微镜（Olympus公司）； 紫外/可见光分光光度计（Beckman DU530）； 荧光定量PCR 仪（ABI公司）； 数显调速多用振荡器（江苏金坛荣华仪器制造有限公司）； 台式低温高速离心机（Hermle和Beckman公司）； PCR扩增仪（PE9600）； 多功能恒温恒压恒流电泳系统（BioRad和Phatmacia公司）； 凝胶成像系统（英国UPV GDS7500）； 凝胶图像光密度分析仪（UVPGDS型，英国）； 微量加样器（Eppendorf公司）； 96孔培养板（美国Becton Dickinson公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 乳腺癌组织标本处理

　　乳腺癌组织标本经液氮、研磨等处理，用于实时荧光定量PCR检测。

　　1.2.2 乳腺癌细胞株培养

　　37 ℃，5%CO2环境下，用含10%胎牛血清的RPMI1640液培养MCF7、T47D、SKBR3细胞，取处于指数增长期细胞用于实时荧光定量PCR检测。

　　1.2.3 总RNA的提取及分析

　　⑴取5m3乳腺癌组织块或1×106个乳腺癌细胞，PBS洗涤3遍，去上清 ⑵1mL的TRIzol溶解细胞，1mL的注射器反复抽提数次； ⑶加入200μL的氯仿，剧烈振荡30s，12000r/min室温离心5min。 ⑷吸上清于RNasefree的EP管中，加入等体积的异丙醇，室温放置5min，12000r/min室温离心5min； ⑸70％酒精700μL洗涤沉淀，12000r/min室温离心5min，共2遍； ⑹吸上清，室温放置将酒精风干； ⑺30～50μL的DEPC水溶解RNA，取少许RNA溶液测定A260/A280值。

　　1.2.4 反转录cDNA第一链

　　⑴取4μg总RNA，1μL的oligo(dT)18混合于置于冰上的EP管中，加DEPC水至12μL，轻轻混合并简短离心； ⑵70℃温育5min，置于冰上少许，简短离心； ⑶加入5×buffer 4μL，RNase抑制剂1μL和10mM的dNTP2μL，轻轻混合并简短离心； ⑷37℃温育5min，加入MMuLV逆转录酶1μL（反应体系共20μL），42℃温育60min，70℃温育10min。

　　1.2.5 TGFβR1、Smad4基因片段的克隆和质粒浓度的测定

　　⑴分别用TGFβR1、Smad4引物，从合成的cDNA上扩增出TGFβR、Smad4基因片段，扩增体系如下 cDNA2μL； dNTP0.5μL； 10×Buffer2.5μL；引物P11μL；引物P21μL； 引物P51μL； 引物P61μL； Taq酶 0.5μL； ddh3O 15.5μL； 总体积25μL； PCR反应条件： 高温预变性时间 95 ℃3min； 变性温度与时间 94 ℃45s； 退火温度与时间 54℃45s； 延伸温度与时间 72℃1min； 反应循环数：30个。⑵基因片段纯化按照优晶公司Gel Extraction Kit 试剂盒说明书操作。 ⑶分别取纯化后的PCR 产物8μL，按照pGEMT 载体试剂盒的说明，构建pGEMTTGFβR1 、pGEMTSmad4质粒。 ⑷转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆子，提纯质粒并进行PCR和测序鉴定（测序工作由英俊公司完成）。⑸纯化的质粒作为标准样品，其用Beckman公司分光光度计测得核酸浓度。

　　1.2.6 标准样品的制备

　　⑴以提纯的pGEMTSMAD4、pGEMTTGFβR，按10 倍系列稀释为101～107copies/μL 作为标准样品，进行荧光定量PCR 扩增。⑵扩增结束后，分别以pMD18TSMAD4、pMD18TTGFR 起始模板浓度(单位为copies/μL) 作为x 轴，Ct 值为y 轴作回归曲线，制作标准曲线。

　　1.2.7 荧光定量PCR 检测

　　将标准样品、待测样品及无模板对照在荧光定量PCR 仪（ABI公司）上做荧光定量PCR 扩增。反应体系及条件如下。cDNA2μL； dNTP0.5μL； Takara PCR premix buffer12.5μL； 引物P1(60nmol/μL) 2μL； 引物P2(60nmol/μL) 2μL； 探针(25pmol/μL) 0.5μL； Taq酶 0.5μL； ddh3O5μL； 总体积25μL； PCR反应条件： 高温预变性时间94℃4min； 变性温度与时间94℃30s ； 退火温度与时间54℃45s； 延伸温度与时间60℃1min； 反应循环数：40个。
　　
　　在每个循环的第二步结束时进行荧光检测。待检样品中核酸数目可通过与标准样品的循环域值（Ct，Threshold Cycle）相比较得出。Ct 值是PCR 循环首先进入指数增长期的循环圈数，用荧光可显示为荧光量的积累超过基底荧光量的循环圈数，Ct 值与起始模板数呈比例关系，Ct 值越小，起始模板数越多；相反，Ct 值越大，起始模板数越少。

　　1.3 统计学处理
　　
　　采用SPSS10.0软件包进行统计分析，定量数据以（±s）表示，两样本均数的比较用t检验。检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 标准样品的制备和标准曲线绘制
　　
　　以提纯的pGEMTTGFβR1、pGEMTSmad4，按10 倍系列稀释为101～107copies/μL 作为标准样品，进行荧光定量PCR 扩增。扩增结束后，分别以pMD18TSmad4、pMD18TTGFβR1起始模板浓度(单位为copies/μL) 作为x 轴，Ct 值为y 轴作回归曲线，制作标准曲线。如下图1，2所示。

　　2.2 FQPCR检测乳腺癌细胞株MCF7、T47D、SKBR3细胞TGFβR1和Smad4表达结果。
　　
　　FQPCR检测发现恶性程度高度的SKBR3细胞，其TGFβR1和Smad4的基因拷贝数明显低于恶性程度低的MCF7细胞（P均&<0.01），T47细胞两种基因拷贝数介于两者之间。具体结果见表1和图3～8。表1 TGFβR1和Smad4在乳腺癌细胞株MCF7、T47D、SKBR3细胞中表达量(略)

　　2.3 FQPCR检测乳腺癌细乳腺癌患者TGFβR1和Smad4表达结果
　　
　　FQPCR检查结果表明，TGFβR1和Smad4在各型乳腺癌细胞中均有表达，随着乳腺癌恶性程度的增加，两者的表达亦明显降低。浸润性癌组TGFβR1和Smad4明显低于非浸润性癌组（P均＜0.01），早期浸润性癌组介于两者之间。如表2所示。表2 TGFβR1和Smad4在各型乳腺癌患者中的表达量（略）

　　3 讨论

　　3.1 TGFβ、Smad4与肿瘤
　　
　　多数研究发现，TGFβ对不同时期的肿瘤存在截然相反的两种不同作用。在肿瘤发生前期，抑制效应为主，主要表现在促进白细胞聚集、细胞分化和细胞凋亡，抑制肿瘤性炎症和基质细胞来源的分裂素的作用等方面。但是，在肿瘤的进展阶段，TGFβ失去对肿瘤的抑制作用，反而能促进肿瘤的演进。这主要表现在：(1)可促进肿瘤逃脱免疫监视和肿瘤生长因子产生；(2)肿瘤侵袭性和扩散能力增强，如导致上皮间质化(epithelialmesenchymal transition， EMT)，肌纤维母细胞运动性增加和肿瘤转移灶形成；(3)促进肿瘤转移和转移灶肿瘤克隆的生长。
　　
　　Smad4首先由Johns Hopkins大学的Hahn等于1996年在Science上报道［5］。其基因定位于18q21染色体上，核苷酸序列保存在Genebank的U44378中。Smad4基因转录子长2680bp，编码由552个氨基酸组成的蛋白，共有11个外显子，其中8、9、10、11是突变热点［6］。Smad 4蛋白分子结构上可划分为3个区：两端是高度保守的氨基端（N末端）和羧基端（C末端），中间是可变的富含脯氨酸的连接区。在Smads家族中，只有Smad4为公共介体，Smads所有生物学效应都是Smad4与任一种Smad蛋白相互作用的结果［7，8］。因此，Smad4蛋白是TGFβ信号转导通路所必需的下游中介分子。目前研究发现，Smad4作为一种抑癌基因，在胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌以及头颈部等多种肿瘤中，存在表达缺失或突变，与多种肿瘤的发生、发展密切相关［9，10］。对胰腺癌、结肠癌和胆管癌等肿瘤Smad4序列分析发现，8、9、11号等外显子存在氨基酸替换［11］。另有报道发现［12］，突变不影响Smad4的活性，相反突变型Smad4比野生型的更容易被激活的泛素连接酶降解，提示通过激活泛素连接酶，诱导突变型Smad4的降解，可能是肿瘤形成和发展的机制之一。而对胰腺癌细胞株的研究证明，对血管发生开关的控制是Smad4抑制肿瘤作用的机制之一。

　　3.2 TGFβ、Smad4与乳腺癌的发生、发展
　　
　　国外研究表明［13，14］，与大多数肿瘤一样，TGFβ在乳腺癌发生发展不同时期中，扮演不同的角色。在乳腺癌早期，TGFβ负性调控作用能抑制肿瘤的生长，而在后期TGFβ抑制作用失活，癌基因的失活和表遗传学改变，使得TGFβ能够促进肿瘤的运动性、侵袭性和转移。另外，最新的研究发现TGFβ能调控肿瘤DNA损害反应，阻碍肿瘤控制［15］。
　　
　　作为TGFβ信号通路最常见的转导子，Smad4对乳腺癌的发生、发展同样起抑制作用［16，17］。另有研究表明，在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞株中，Smad4能通过诱导凋亡作用抑制乳腺癌生长［18，19］；并且在乳腺上皮细胞Smad4基因敲出的裸鼠中，几乎100%雌鼠演变成为乳腺鳞状上皮癌，而雄鼠则几乎没有，提示Smad4与乳腺癌密切相关，Smad4可能通过雌激素受体途径参与乳腺癌发生、发展［20］。

　　3.3 本部分实验结果的意义
　　
　　本部分实验利用荧光定量PCR技术，从TGFβR1和Smad4 mRNA表达水平，定量探讨了它们在乳腺癌发生、发展的意义。结果发现，随着乳腺癌细胞病理类型恶性程度增加，TGFβR1和Smad4 mRNA表达逐步下降，表明TGFβ1和Smad4可能具有类似乳腺癌抑癌基因的作用。由于体内存在多种转录后调控机制，mRNA水平的变化与蛋白水平变化有时并不完全一致。因此，在接下来的第二部分工作中，我们将进一步探讨乳腺癌TGFβ1 、TGFβR1和Smad4蛋白水平变化，从而更加深入理解TGFβ/Smads通路在乳腺癌演变中的作用。

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