尾加压素Ⅱ体外促进晶状体上皮细胞增殖的细胞信号转导机制

　　　　 作者：黄秀榕，祁明信，李坤鹏，陈义

【摘要】 　　目的：探讨尾加压素Ⅱ (urotensin Ⅱ， UⅡ) 促进晶状体上皮细胞（lens epithelial cell， LEC）增殖的细胞信号转导机制。方法：采用UⅡ与体外培养的LEC共同孵育，并用4种细胞信号转导阻断剂H7，PD98059，W7，尼卡地平(nicardipine) 分别作用于LEC，再用3H –胸腺嘧啶（3HTdR）掺入法检测LEC增殖的情况。结果：UⅡ组LEC的3H掺入放射活性显著高于对照组(P&<0.01)，4种信号转导阻断剂组的放射活性与UⅡ组比较均有不同程度的降低(P&<0.01，P&<0.01)。PD98059 和H7 的阻断作用强于nicardipine 和W7（F= 13.251，P&<0.01）。 结论：尾加压素Ⅱ促进LEC增殖是通过细胞信号转导的机制，该作用可被信号转导阻断剂所阻断。

【关键词】 尾加压素Ⅱ；晶状体上皮细胞；增殖；细胞信号转导；后发性白内障

　　AbstractAIM：To study the mechanism on signal transduction of proliferation induced by urotensinⅡ(UⅡ)in lens epithelial cell（LEC）. METHODS：UⅡ were incubated with cultured LEC. Meanwhile four blockers of signal transduction， H7， PD98059， W7 and nicardipine， were incubated with LEC separately. Then the proliferations of LEC were detected via 3HTdR incorporation. RESULTS：The radioactivity of 3HTdR in UⅡ group was higher than that in control group(P&<0.01). The radioactivities of 3HTdR in groups of four blockers decreased in varying degrees compared with UⅡ group(P&<0.01，P&<0.01). The blocking effects of PD98059 and H7 were higher than that of nicardipine and W7（F= 13.251，P&<0.01）. CONCLUSION：UⅡ induced LEC proliferation by means of signal trasduction which can be blocked by four signal transduction blockers. The result provides a new thinking for prevention and treatment of after cataract.
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　　KEYWORS：urotensin Ⅱ; lens epithelial cell; proliferation; signal transduction; after cataract

　　0　引言
　　
　　尾加压素Ⅱ（urotensin Ⅱ， UⅡ）是一种具有多种生物学效应的新型生物活性物质。最早由Coulouarn于1998年从人体中克隆出人UⅡ（human urotensin Ⅱ， hUⅡ）[1]。此后的研究表明，体内多种组织中含有UⅡ。UⅡ不仅具有强烈的缩血管作用[2] ，而且具有促进细胞增殖的作用，可使大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞和血管平滑肌细胞等发生增殖[3]。我们曾发现眼部各组织均含有UⅡ，并发现UⅡ具有促进晶状体上皮细胞（lens epithelial cell， LEC）增殖的作用。后发性白内障 (after cataract)是白内障囊外摘除联合人工晶状体植入术后的主要并发症。其病理生理机制是手术后残留的LEC发生增殖、移行，使晶状体后囊膜发生混浊导致视力再度下降。我们拟探讨UⅡ促进LEC增殖的细胞信号转导机制，为防治后发性白内障寻求新的途径。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　无菌操作取健康新鲜小牛眼的晶状体前囊膜，用胰蛋白酶消化法，在37℃，5%CO2培养箱中进行晶状体上皮细胞原代和传代培养，取第3代细胞进行如下实验。hUⅡ，H7，PD98059，W7，尼卡地平(nicardipine)均系美国Sigma公司产品，DMEM培养基为美国GIBCO公司产品， 3H –胸腺嘧啶（3HTdR）购自上海原子核研究所，2，5二苯基恶唑（PPO）及1，4双（5苯基恶唑基2）苯（POPOP）为中国医药集团上海化学试剂公司产品，胰蛋白酶（trypsin）购自华美生物工程公司，胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，冰醋酸、二甲苯为市售分析纯产品。本研究采用CO2培养箱（美国FORMA 2111）、倒置研究显微镜（日本Olympus IMT413）、低温冰箱（日本MDFV5410）、真空泵（美国Nulgene EF006）、微量移液器（法国Gilson）、γ液闪计数仪（西安FJ2003PS）。

　　1.2　方法

　　将实验分成6组，每组8个样本。对照组在LEC中加入胎牛血清和DMEM培养液。UⅡ组在对照组的基础上加入终浓度为108mol/L的UⅡ。H7组、PD98059组、W7组和尼卡地平组分别在UⅡ组的基础上加入4种细胞信号转导阻断剂，终浓度分别为H7 105mol/L，PD98059 105mol/L，W7 106mol/L，Nicardipine 105mol/L。取第3代培养的LEC并使细胞生长同步化。在CO2培养箱中继续培养12h后，按照上述实验分组，分别加入hUⅡ和H7，PD98059，W7和尼卡地平。将LEC在CO2培养箱中继续培养12h后，吸去培养液，每孔分别加入3HTdR（其放射比活性为每孔3.7×104个/min），继续培养12h。吸去培养液，消化细胞并用真空泵抽滤，将细胞收集于玻璃纤维膜上。于60℃，30min条件下烘干滤膜，用液闪计数仪测定 3H放射活性。
　　
　　统计学分析：用SPSS 12.0统计软件分析。所有结果用均数± 标准差（ ±s）表示。各组与对照组间数据比较采用t检验，各组间数据比较采用单因素方差OneWay ANOVA分析。

　　2　结果
　　
　　UⅡ组LEC的3H掺入放射活性（个/min）显著高于对照组(2027.4±109.1 vs 1203.8±107.6，P&<0.01)，说明UⅡ使LEC发生明显的增殖。4种信号转导阻断剂组的放射活性与UⅡ组比较均有不同程度的降低(1819.6±47.2，1759.1±169.0，1557.9±71.9，1442.9±192.4，P&<0.01， P&<0.01)，显示这4组LEC的增殖减少，表明4种阻断剂均不同程度地阻断了UⅡ促进LEC增殖的信号转导途径。在4种阻断剂中，PD98059组和H7 组的放射活性显著低于W7组和Nicardipine组（F=13.251，P&<0.01），表明PD98059组和H7 组对UⅡ促进LEC增殖的细胞信号转导途径的阻断作用更强（表1）。表13HTdR掺入法检测4种信号转导阻断剂对UⅡ诱导LEC增殖的影响 (略)

　　3　讨论
　　
　　UⅡ是一种生长抑素样环型结构的神经肽，最早提取自鱼的尾部下垂体，1998年首次从人体克隆出来。研究表明，UⅡ是具有多种生物学效应的新型生物活性物质，具有较强的促进多种细胞增殖的作用。UⅡ可刺激离体培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell， VSMC)发生增殖，呈浓度依赖关系；降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、IL10等均能抑制由UⅡ诱导的VSMC增殖；UⅡ上调VSMC内皮素基因表达并促进VSMC内皮素的合成释放；肾上腺髓质素可浓度依赖性地抑制UⅡ刺激的VSMC内皮素mRNA水平的增加[46]。还有报道UⅡ能促进实验大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞发生增殖，且在一定的浓度范围内其促增殖作用具有浓度依赖性。有关UⅡ促进细胞增殖作用的细胞信号转导机制已有报道[7]，UⅡ促进细胞增殖的途径与Ca2+介导的信号转导通路有密切关系。另有文献指出[8]，抑制与有丝分裂有关的多种信号蛋白分子，如csrc，PKC(protein kinase C)，CaMPK，MAPK(mitogen activated protein kinase)，钙调神经磷酸酶(CaN)，均可在不同程度上抑制UⅡ的有丝分裂效应，从而抑制UⅡ刺激细胞增殖的作用。Watanabe等[9] 研究发现，PKCCaMGPCRMAPK的阻断剂可抑制UⅡ对VSMC的增殖作用，从而间接表明UⅡ是通过PKCCaMGPCRMAPK信号转导途径发挥其促增殖的作用。
　　
　　我们曾发现，眼内各组织中均有一定量的UⅡ，UⅡ能显著促进LEC发生明显的增殖并呈浓度依赖关系。在此基础上，我们采用3HTdR掺入法检测4种细胞信号转导阻断剂对UⅡ促进LEC增殖的影响，以探讨UⅡ促进LEC 增殖的信号转导机制。这4种信号转导阻断剂中，H7是蛋白激酶C（PKC）抑制剂，PD98059是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂，W7是钙调素（CaM）抑制剂，尼卡地平(Nicardipine)是钙通道阻滞剂。研究结果发现，4种信号转导阻断剂均能降低LEC的放射活性、阻断UⅡ促进LEC增殖的信号转导通路，使UⅡ促进LEC增殖的作用减弱。间接表明UⅡ是通过DG蛋白激酶C途径、受体酪氨酸蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶途径、Ca2+和钙调蛋白激酶途径等细胞信号转导途径发挥其促进LEC增殖的作用，从而探明了UⅡ促进LEC增殖的细胞信号转导机制。
　　
　　白内障囊外摘除联合人工晶状体植入手术后残留的LEC发生增殖，并移行至后囊下形成再生的晶状体结构如珍珠样（Elschnig）小体及Soemmering环，再向成纤维细胞转化、分泌胶原形成纤维膜， 使晶状体后囊膜发生混浊，导致白内障术后视力再度下降。这是后发性白内障的主要病理生理过程。我们的前期研究发现UⅡ能促进LEC增殖，提出其很可能是后发性白内障的一个重要发生机制。我们的研究结果发现，4种细胞信号转导阻断剂均能阻断UⅡ促进LEC增殖的信号转导通路，使UⅡ促进LEC增殖作用减弱。该结果一方面表明UⅡ促进LEC增殖的作用及其细胞信号转导机制，阐明了后发性白内障发生发展的可能机制；另一方面揭示采用信号转导阻断剂可阻断UⅡ促LEC增殖作用，减少白内障手术后的后囊膜混浊，提出这可能是防治后发性白内障的一个新途径。经广泛查阅国内外文献，有关UⅡ促进晶状体上皮细胞等眼内组织细胞增殖的研究尚未见报道，更未见UⅡ促进LEC增殖作用的细胞信号转导机制的研究报道，本研究具有一定的科学意义和应用前景。

参考文献

　　1　Matsushita M， Shichiri M， Fukai N， et al. Urotensin II is an autocrine/paracrine growth factor for the porcine renal epithelial cell line. Endocrinol 2003;144（5）:18251831

　　2　Maguire JJ， Kue RE， Davenport AP. Ophenreceptor ligand human urotensin II: receptor localization in human tissues and comparison of vasoconstrictor responses with endothelin1. Br J Pharmacol 2000;131(3):441446

　　3　张勇刚， 陈亚红， 马春艳， 等. 尾加压素的促丝裂作用．中国动脉硬化杂志 2001;9(1):1416

　　4　夏春芳，霍勇，尹航， 等. IL10对尾加压素II诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响．北京大学学报(医学版) 2001;33(4):332334

　　5　齐永芬， 夏春芳， 陈亚红， 等. 肾上腺髓质素对尾加压素II刺激的血管平滑肌细胞增殖的影响．中国病理生理杂志 2002;18(3):230232

　　6　袁杰，李菊香，李国华，等.降钙素基因相关肽对尾加压素II诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响．贵阳医学院学报 2002；21(3):129132

　　7　强正浩， 张孙曦， 李菊香， 等. 钙信号在尾加压素II促血管平滑肌增殖中的作用．北京大学学报（医学版）2002; 34(3):261265

　　8　陈亚红， 赵鸣武， 夏春芳， 等. 尾加压素在大鼠气管平滑肌细胞增殖中的作用及其机制．中华医学杂志 2002;80(12):928930

　　9　Watanabe T， Pakala R， Katagiri T， et al. Synergistic effect of urotensinII with mildly oxidized LDL on DNA synthesis on vascular smooth muscle cells. Circulation 2001;4(1):1618