尾加压素Ⅱ促进晶状体上皮细胞增殖的实验研究

　　　　　　 作者：黄秀榕，祁明信，李坤鹏，陈义

【摘要】 　　目的：探讨尾加压素Ⅱ (urotensin Ⅱ， UⅡ)对晶状体上皮细胞（lens epithelial cell， LEC）增殖的影响。方法：采用不同浓度的UⅡ与体外培养的LEC共同孵育后，用MTT法检测LEC的活性，并用3H 胸腺嘧啶（3HTdR）掺入法检测LEC增殖。 结果：109mol/L UⅡ组、108mol/L UⅡ组、107mol/L UⅡ组和106mol/L UⅡ组的吸光度值均显著高于对照组(P&<0.05，P&<0.05，P&<0.01，P&<0.01)。1010mol/L UⅡ组、109mol/L UⅡ组、108mol/L UⅡ组、107mol/L UⅡ组和106mol/L UⅡ组的3H掺入放射活性均显著高于对照组(P&<0.01)，分别是对照组的1.36倍、1.40倍、1.45倍、1.59倍和1.66倍。呈浓度依赖关系。结论：UⅡ具有促进LEC增殖的作用。

【关键词】 尾加压素Ⅱ； 晶状体上皮细胞；增殖；后发性白内障

　　AbstractAIM: To study the effect of urotensin Ⅱ ( UⅡ)，a new biological activity substance， on proliferation of lens epithelial cell(LEC). METHODS: Different concentrations of UⅡ were incubated with in vitro cultured LEC in vitro. The activities of LEC were detected via methyl thiazolyl tetrazolium(MTT). The proliferations of LEC were detected via 3HTdR.RESULTS: The absorbences of groups 109mol/L UⅡ， 108mol/L UⅡ， 107mol/L UⅡ and 106mol/L UⅡ were higher than that in control group (P&<0.05，P&<0.05，P&<0.01，P&<0.01); the radioactivities of 3HTdR in groups 1010mol/L， 109mol/L UⅡ， 108mol/L UⅡ， 107mol/L UⅡ and 106mol/L UⅡ were higher than that in control group (P&<0.01)， which were 1.36， 1.40， 1.45， 1.59 and 1.66 times respectively， with a dosedependent manner. CONCLUSION: UⅡ can induce proliferation of LEC.

　　KEYWORDS: urotensin Ⅱ; lens epithelial cell; proliferation; after cataract

　　0　引言
　　
　　人尾加压素Ⅱ（human urotensin Ⅱ， hUⅡ）具有多种生物学效应[1， 2]。体内多种组织中含有UⅡ，我们的研究也发现，眼部各组织均含有UⅡ。不少研究还表明，UⅡ具有促进细胞增殖的作用，可使大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞和血管平滑肌细胞等发生增殖[3]。白内障囊外摘除联合人工晶状体植入术后的主要并发症之一是视力再度下降，称为后发性白内障 (after cataract)。这是由于手术后残留的晶状体上皮细胞（lens epithelial cell， LEC）发生增殖、移行，使晶状体后囊膜发生混浊所致。本文研究UⅡ对晶状体上皮细胞增殖的影响，探讨后发性白内障的发生机制并寻求防治方法。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　采用健康新鲜小牛眼，无菌操作取晶状体前囊膜，用胰蛋白酶消化法在37℃，5%CO2培养箱中作晶状体上皮细胞原代和传代培养，取第3代细胞进行如下实验。hUⅡ为美国Sigma公司产品，3H 胸腺嘧啶（3HTdR）购自上海原子核研究所，H7，PD98059，W7，尼卡地平(nicardipine)均系美国Sigma公司产品，二甲基亚砜（DMSO）系美国Amresco公司产品，DMEM培养基为美国GIBCO公司产品，2，5二苯基恶唑（PPO）及1，4双（5苯基恶唑基2）苯（POPOP）为中国医药集团上海化学试剂公司产品。全自动酶标读数仪(购自美国BioTek ELX808)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　LEC活性的检测

　　取第3代培养的LEC，台盼蓝染色，计算活细胞数并调整细胞密度至5×108个/L，在37℃，5% CO2培养箱中常规培养24h，使细胞同步化。将实验分成6组，每组8个样本。对照组在LEC内加入DMEM培养液，1010UⅡ组，109UⅡ组，108UⅡ组，107UⅡ组和106UⅡ组分别在对照组基础上加入终浓度为1010mol/L，109mol/L，108mol/L，107mol/L和106mol/L的hUⅡ。置CO2培养箱中继续培养72h后，吸去培养液，每孔分别加入终浓度为0.5g/L的MTT 100μL。CO2培养箱中继续放置4h后，加入DMSO溶液100μL，振荡10min后室温下静置5min，于全自动酶标仪上用490nm比色测定吸光度A值。

　　1.2.2　LEC增殖的检测

　　取第3代培养的LEC并使细胞生长同步化。按照上述实验分组，分别加入不同浓度的hUⅡ，每组8个样本，CO2培养箱中继续培养12h后，吸去培养液，每孔分别加入3HTdR（其放射比活性为每孔3.7×104个/min），继续培养12h。吸去培养液，消化细胞并用真空泵抽滤，将细胞收集于玻璃纤维膜上。于60℃，30min条件下烘干滤膜，用液闪计数仪测定 3H放射活性。
　　
　　统计学分析:用SPSS 12.0统计软件分析。所有结果用均数±标准差（±s）来表示。各组与对照组间数据比较采用t检验，各组间数据比较采用单因素方差OneWay ANOVA分析。

　　2　结果

　　2.1　UⅡ可增加LEC活性

　　1010mol/L UⅡ组的吸光度值与对照组无显著差异(P&>0.05)，说明1010mol/L UⅡ不能使LEC活性增高。109mol/L，108mol/L，107mol/L和106mol/L 组UⅡ的吸光度值均显著高于对照组(P&<0.05，P&<0.05，P&<0.01，P&<0.01)，其吸光度值分别是对照组的1.26倍、1.40倍、1.45倍和2.05倍。说明106mol/L～109mol/L UⅡ均有使LEC活性增高的作用，且随UⅡ 浓度增加，使LEC活性增高的作用越强，呈浓度依赖关系（表1）。表1UⅡ对LEC活性和增殖的影响(略)

　　2.2　UⅡ可促进LEC增殖

　　1010mol/L UⅡ组，109mol/L UⅡ组，108mol/ L UⅡ组，107mol/L UⅡ组和106mol/L UⅡ组的UⅡ3H掺入放射活性（个/min）均显著高于对照组(P&<0.01)，其放射活性分别是对照组的1.36倍、1.40倍、1.45倍、1.59倍和1.66倍。说明浓度范围在106mol/L～1010mol/L 的UⅡ均有使LEC增殖的作用，且随UⅡ 浓度增加，使LEC增殖的作用越强（F=17.893，P&<0.05 ），呈浓度依赖关系（表1）。

　　3　讨论
　　
　　研究表明UⅡ是具有多种生物学效应的新型生物活性物质。除了具有很强的收缩血管的作用之外，UⅡ还具有促进细胞增殖的作用。有报道UⅡ可明显促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖，使G0期细胞进入细胞周期。UⅡ还能促进实验大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞发生增殖，且在一定的浓度范围内其促增殖作用具有浓度依赖性[4]。另有研究表明，UⅡ可刺激离体培养的大鼠胸主动脉VSMC发生增殖、呈浓度依赖关系。且降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、IL10等均能抑制由UⅡ诱导的VSMC增殖；UⅡ上调VSMC内皮素基因表达并促进VSMC内皮素的合成释放；肾上腺髓质素可浓度依赖性地抑制UⅡ刺激的VSMC内皮素mRNA水平的增加[46]。
　　
　　经广泛查阅国内外文献，有关UⅡ促进眼组织细胞增殖的研究尚未见报道，更未见UⅡ促进晶状体上皮细胞增殖的报道。本研究用不同浓度的UⅡ与体外培养的牛晶状体上皮细胞共同孵育，经MTT法检测发现UⅡ使LEC细胞活性显著增高；经3HTdR掺入法检测发现UⅡ能显著促进LEC发生增殖。且在一定的浓度范围内，随着UⅡ浓度增高，其所促进的LEC活性增高越明显、促进LEC增殖越明显，即UⅡ促进LEC增殖呈明显的浓度依赖关系。

　　检测细胞增殖这一重要生物学特性的指标有细胞计数法、MTT检测法、放射性核苷酸掺入法等。MTT法检测细胞活性从而反映细胞增殖的原理是：细胞增殖时由于线粒体能量代谢旺盛、产生的琥珀酸脱氢酶增多，该酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色的结晶沉积在细胞内或细胞周围，因此细胞增殖时形成的结晶多。在结晶中加入二甲基亚砜使结晶溶解后即可在酶标仪上比色读得吸光度值。故吸光度值越高，表示活细胞数越多、细胞增殖越明显。 3HTdR掺入法检测细胞增殖的原理是：用放射性同位素 3H标记的胸腺嘧啶掺入细胞内，再用γ液闪计数仪测定 3H放射活性。如3HTdR掺入细胞增加，则测得的 3H放射活性高，反映细胞内DNA合成增多、说明细胞发生了增殖。本研究采用MTT法和3HTdR掺入法检测LEC增殖，两种方法的研究结果是一致的，均表明UⅡ能促进LEC发生增殖，并呈浓度依赖关系。
　　
　　后发性白内障的基本病理过程是白内障手术后残留的LEC发生增殖，同时移行至后囊下形成再生的晶状体结构如珍珠样（Elschnig）小体及Soemmering环，并向成纤维细胞转化、分泌胶原形成纤维膜， 使晶状体后囊膜发生混浊而使白内障术后视力再度下降。本项目组的其他研究曾发现UⅡ在人眼各组织中均有一定的含量。我们又发现UⅡ能促进体外培养的LEC发生增殖，揭示UⅡ促进手术后残留的晶状体上皮细胞发生增殖很可能是后发性白内障发生的重要机制之一，为防治后发性白内障提出一个新的思路，具有一定的科学意义。

参考文献

　　1　Matsushita M， Shichiri M， Fukai N， et al. Urotensin Ⅱ is an autocrine/paracrine growth factor for the porcine renal epithelial cell line. Endocrinology 2003;144(5):18251831

　　2　Maguire JJ， Kue RE， Davenport AP. Ophenreceptor ligand human urotensin Ⅱ: receptor localization in human tissues and comparison of vasoconstrictor responses with endothelin1. Br J Pharmacol 2000;131(3):441446

　　3　张勇刚，陈亚红，马春艳，等．尾加压素的促丝裂作用．中国动脉硬化杂志2001;9(1):1416

　　4　夏春芳，霍勇，尹航， 等．IL10对尾加压素Ⅱ诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响．北京大学学报(医学版) 2001;33(4): 332334

　　5　齐永芬， 夏春芳， 陈亚红， 等．肾上腺髓质素对尾加压素Ⅱ刺激的血管平滑肌细胞增殖的影响．中国病理生理杂志 2002;18(3):230232

　　6　袁杰， 李菊香， 李国华， 等．降钙素基因相关肽对尾加压素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响．贵阳医学院学报 2002;21(3):129132

　　1.2.2　LEC增殖的检测

　　取第3代培养的LEC并使细胞生长同步化。按照上述实验分组，分别加入不同浓度的hUⅡ，每组8个样本，CO2培养箱中继续培养12h后，吸去培养液，每孔分别加入3HTdR（其放射比活性为每孔3.7×104个/min），继续培养12h。吸去培养液，消化细胞并用真空泵抽滤，将细胞收集于玻璃纤维膜上。于60℃，30min条件下烘干滤膜，用液闪计数仪测定 3H放射活性。
　　
　　统计学分析:用SPSS 12.0统计软件分析。所有结果用均数±标准差（±s）来表示。各组与对照组间数据比较采用t检验，各组间数据比较采用单因素方差OneWay ANOVA分析。

　　2　结果

　　2.1　UⅡ可增加LEC活性

　　1010mol/L UⅡ组的吸光度值与对照组无显著差异(P&>0.05)，说明1010mol/L UⅡ不能使LEC活性增高。109mol/L，108mol/L，107mol/L和106mol/L 组UⅡ的吸光度值均显著高于对照组(P&<0.05，P&<0.05，P&<0.01，P&<0.01)，其吸光度值分别是对照组的1.26倍、1.40倍、1.45倍和2.05倍。说明106mol/L～109mol/L UⅡ均有使LEC活性增高的作用，且随UⅡ 浓度增加，使LEC活性增高的作用越强，呈浓度依赖关系（表1）。表1UⅡ对LEC活性和增殖的影响(略)

　　2.2　UⅡ可促进LEC增殖

　　1010mol/L UⅡ组，109mol/L UⅡ组，108mol/ L UⅡ组，107mol/L UⅡ组和106mol/L UⅡ组的UⅡ3H掺入放射活性（个/min）均显著高于对照组(P&<0.01)，其放射活性分别是对照组的1.36倍、1.40倍、1.45倍、1.59倍和1.66倍。说明浓度范围在106mol/L～1010mol/L 的UⅡ均有使LEC增殖的作用，且随UⅡ 浓度增加，使LEC增殖的作用越强（F=17.893，P&<0.05 ），呈浓度依赖关系（表1）。

　　3　讨论
　　
　　研究表明UⅡ是具有多种生物学效应的新型生物活性物质。除了具有很强的收缩血管的作用之外，UⅡ还具有促进细胞增殖的作用。有报道UⅡ可明显促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖，使G0期细胞进入细胞周期。UⅡ还能促进实验大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞发生增殖，且在一定的浓度范围内其促增殖作用具有浓度依赖性[4]。另有研究表明，UⅡ可刺激离体培养的大鼠胸主动脉VSMC发生增殖、呈浓度依赖关系。且降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、IL10等均能抑制由UⅡ诱导的VSMC增殖；UⅡ上调VSMC内皮素基因表达并促进VSMC内皮素的合成释放；肾上腺髓质素可浓度依赖性地抑制UⅡ刺激的VSMC内皮素mRNA水平的增加[46]。
　　
　　经广泛查阅国内外文献，有关UⅡ促进眼组织细胞增殖的研究尚未见报道，更未见UⅡ促进晶状体上皮细胞增殖的报道。本研究用不同浓度的UⅡ与体外培养的牛晶状体上皮细胞共同孵育，经MTT法检测发现UⅡ使LEC细胞活性显著增高；经3HTdR掺入法检测发现UⅡ能显著促进LEC发生增殖。且在一定的浓度范围内，随着UⅡ浓度增高，其所促进的LEC活性增高越明显、促进LEC增殖越明显，即UⅡ促进LEC增殖呈明显的浓度依赖关系。

　　检测细胞增殖这一重要生物学特性的指标有细胞计数法、MTT检测法、放射性核苷酸掺入法等。MTT法检测细胞活性从而反映细胞增殖的原理是：细胞增殖时由于线粒体能量代谢旺盛、产生的琥珀酸脱氢酶增多，该酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色的结晶沉积在细胞内或细胞周围，因此细胞增殖时形成的结晶多。在结晶中加入二甲基亚砜使结晶溶解后即可在酶标仪上比色读得吸光度值。故吸光度值越高，表示活细胞数越多、细胞增殖越明显。 3HTdR掺入法检测细胞增殖的原理是：用放射性同位素 3H标记的胸腺嘧啶掺入细胞内，再用γ液闪计数仪测定 3H放射活性。如3HTdR掺入细胞增加，则测得的 3H放射活性高，反映细胞内DNA合成增多、说明细胞发生了增殖。本研究采用MTT法和3HTdR掺入法检测LEC增殖，两种方法的研究结果是一致的，均表明UⅡ能促进LEC发生增殖，并呈浓度依赖关系。
　　
　　后发性白内障的基本病理过程是白内障手术后残留的LEC发生增殖，同时移行至后囊下形成再生的晶状体结构如珍珠样（Elschnig）小体及Soemmering环，并向成纤维细胞转化、分泌胶原形成纤维膜， 使晶状体后囊膜发生混浊而使白内障术后视力再度下降。本项目组的其他研究曾发现UⅡ在人眼各组织中均有一定的含量。我们又发现UⅡ能促进体外培养的LEC发生增殖，揭示UⅡ促进手术后残留的晶状体上皮细胞发生增殖很可能是后发性白内障发生的重要机制之一，为防治后发性白内障提出一个新的思路，具有一定的科学意义。

参考文献

　　1　Matsushita M， Shichiri M， Fukai N， et al. Urotensin Ⅱ is an autocrine/paracrine growth factor for the porcine renal epithelial cell line. Endocrinology 2003;144(5):18251831

　　2　Maguire JJ， Kue RE， Davenport AP. Ophenreceptor ligand human urotensin Ⅱ: receptor localization in human tissues and comparison of vasoconstrictor responses with endothelin1. Br J Pharmacol 2000;131(3):441446

　　3　张勇刚，陈亚红，马春艳，等．尾加压素的促丝裂作用．中国动脉硬化杂志2001;9(1):1416

　　4　夏春芳，霍勇，尹航， 等．IL10对尾加压素Ⅱ诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响．北京大学学报(医学版) 2001;33(4): 332334

　　5　齐永芬， 夏春芳， 陈亚红， 等．肾上腺髓质素对尾加压素Ⅱ刺激的血管平滑肌细胞增殖的影响．中国病理生理杂志 2002;18(3):230232

　　6　袁杰， 李菊香， 李国华， 等．降钙素基因相关肽对尾加压素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响．贵阳医学院学报 2002;21(3):129132