TGFβ1基因转染对人晶状体上皮细胞周期调控的影响

【摘要】 　　目的：探讨脂质体介导的TGFβ１基因（pEGFPTGFβ１）转染诱导人晶状体上皮细胞系B3(HLECB3)细胞周期蛋白激酶抑制因子p21及细胞周期蛋白激酶CDK2的表达及其对细胞周期调控的影响。方法：将pEGFPTGFβ１转染人晶状体上皮细胞系B3(HLEC B3)，采用RTPCR和Westernblot方法检测pEGFPTGFβ１转染后24，48，72，96h p21，CDK2和 Smad4 mRNA和蛋白的表达，设立正常细胞组及pEGFPC2转染组为对照组。结果：pEGFPTGFβ1转染组TGFβ1 24h开始升高，48h达到最高，72h略有减少，96h明显减少，但仍高于正常组，而空载体组与正常细胞组则无明显变化。p21变化趋势和TGFβ1相符，CDK2组变化趋势则正好相反，Smad4组48h明显升高，72h下降明显，96h基本恢复正常。结论:TGFβ1通过活化凋亡基因p21，降低细胞周期蛋白激酶CDK2。

【关键词】 晶状体上皮细胞；TGFβ1基因；转染；p21;CDK2;Smad4

　　AbstractAIM: To investigate the change of p21，CDK2 and Smad4 on the HLEC transfected with pEGFPTGFβ1 plasmid and the effect of TGFβ１gene transfection on the cell cycle control of human lens epithelial cell. METHODS:Immortalized human lens epithelial cellline(HLEC B3) was transfered by pEGFPTGFβ1 gene. The expression of TGFβ1mRNA，p21mRNA，CDK2mRNA and Smad4 mRNA and protein induced by transfered by TGFβ1 gene were measured by RTPCR and Western blot at different time periods .RESULTS: RTPCR detected that TGFβ1mRNA began to raise after 24h， culminated after 48h ，decreased after 72h，decreased much after 96h，but still more than the normal. p21mRNA companied with it. but CDK2 decreased with it. Westernblot detected that the consequence consisted with RTPCR.The effect of TGFβ1 gene was demonstrated from the lever of transcription and translation.Smad4 protein raised with the lever of TGFβ1 gene at various time point， but disappeared very quickly.CONCLUSION:TGFβ1 can increase p21，but decrease CDK2，to impact the cell cycle of HLEC. TGFβ/Smad4 pathway take part in the course.

　　KEYWORDS:lens epithelial cells; TGFβ1; genes transfer; p21;CDK2 ；Smad4

　　0　引言
　　
　　转化生长因子β(TGFβ)可抑制上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞，以及某些肿瘤细胞的生长，并使这些细胞停滞在细胞周期的第一个间隔区：G1期，从而阻止细胞进入S期[1]。许多研究表明，高表达活性 TGFβ1的转基因鼠和其体外培养鼠晶状体均出现晶状体混浊的症状[2，3]，我们的前期实验证明TGFβ1可抑制晶状体上皮细胞增殖，改变细胞周期，诱导其发生凋亡。目前已经发现TGFβ信号传导经典途径为: TGFβ配体与细胞膜受体结合，激活细胞内Smads蛋白，协同多种转录因子，最终导致目的基因表达。Smads类蛋白是TGFβ信号转导通路中必不可少的中介蛋白，存在于胞质中[4]。Smad4是通用枢纽分子，与上游分子形成核转运复合物后，将信号由胞质传入核内，协同转录因子上调或下调靶基因的表达。Smad4由于其中枢作用而被认为是调控TGFβ信号通路的关键分子。我们通过基因转染技术对TGFβ1抑制人晶状体上皮细胞，导致白内障发生的具体作用机制进行探讨。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　永生化细胞系HLECB3(中国医科大学眼科)，HGDMEM培养液（美国Highclone公司），胎牛血清（杭州四季青生物公司）， pSNAVTGFβ1，pEGFPC2质粒（北京本元正阳基因技术有限公司），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）， Trizol试剂盒（GIBCO/BRL公司）; RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0（大连宝生物工程公司）;蛋白质免疫印迹化学发光试剂盒（德国Borhringer Mannheim公司）;鼠抗人CDK2及p21（NEB公司）;生物素标记的蛋白质标准样品，抗生物素标记的蛋白质标准二抗（美国NEB公司）。复苏时将冻存细胞系HLEC  B3从液氮罐中取出，快速放入37℃温水中溶解，溶化后以1200r/min离心约3～5min，离心半径为15cm。弃培养液后，放入含150mL/L胎牛血清、100mg/Ｌ青霉素及125mg/Ｌ链霉素的HGDMEM培养基中，置于50mL/L CO2，37℃的细胞培养箱内培养。EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pSNAVTGFβ1，回收插入片断（1.8kb），EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pEGFPC2，回收线性载体(4.7kb)，连接上述二种回收的DNA，转化，筛选克隆，构建后的质粒命名为pEGFP TGFβ1。

　　1.2　方法

　　转染前1ｄ将细胞接种至6孔板，细胞度为1×108个/Ｌ，在50mL/L CO2，37℃饱和湿度下培养24h，90%细胞达到融合;转染前使用PBS缓冲液冲洗细胞1次，更换不含抗生素的培养液。无血清HGDMEM250μL稀释pEGFP TGFβ14μg，温和摇匀。使用前轻轻混匀Lipofectamine2000，然后将Lipofectamine 2000 10μL加入无血清的HGDMEM 250μL，混匀并于室温温育5min。混合稀释的质粒和Lipofectamine 2000混匀，室温下放置20min。将质粒/Lipofectamine 2000复合物加入到6孔板的孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在50mL/L CO2，37℃饱和湿度下培养，6h后更换含150mL/L胎牛血清的HGDMEM培养基。将转染细胞，每日在倒置显微镜下观察并记录细胞的形态变化。实验分为pEGFPTGFβ1转染 24，48，72，96h组；pEGFPC2转染24，48，72，96h组；正常细胞对照组。提取总RNA，按照Trizol试剂盒说明书进行，参照Genebank的cDNA序列，用Primer Premier 5软件设计引物:TGFβ1:5 CTGTGGCTACTGGTGCTGAC 3;5CATAG ATTTCGTTGTGGGTTTC 3；p21:5CCCGTGAGCGATGGAA CT3;5CGAGGCACAAGGGTACAAGA3;CDK2：5CCGCCT GGACACTGAGACT3;5GAGGAGGACCCGATGAGA3;Smad 4：5CTGCCAACTTTCCCAACAT 3;5AGAAGGGTCCACGT ATCCA 3;PCR反应按下列组成配制PCR反应液：5×Pcr buffer10μL、灭菌蒸馏水28.75μL，TaKaRa Ex TaqHS 0.25μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL，将PCR反应液加入到反转录反应结束后的PCR反应管中按下列条件进行PCR反应：94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃～65℃退火30s，72℃延伸0.5～4min，变性至延伸进行30个循环，反应结束后，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。实验重复3离心次。另实验分组同RTPCR，终止培养后，用冰冷的0.02mol/L PBS冲洗细胞3次，置于冰盒上，用细胞刮取器刮下细胞，置于Eppendorf管内，加入裂解液(2mmol/L/EDTA，10mmol/L/EGTA，20mmol/L/TrisHCL， pH7.5，2mmol/L MmPMSF， 0.25mol/L蔗糖) 300μL超声粉碎，4℃离心，17500r/min离心2h，将其标准化，将蛋白液样品用120g/LSDSPAGE分离而后电转移至硝酸纤维膜上，含50g/L牛血清白蛋白的TTBS封闭1h，加上特异性一抗(1∶400)4℃过夜，TBS洗4次，10min/次，加入碱性磷酸酶(1B2000)，室温孵育2h，加入BNaphthylacidphosphate和odignisidinetetrazotized显色，膜经Kodak1D型凝胶自动成像扫描分析，记录吸光度，实验重复3次。

　　2　结果

　　2.1　TGFβ1，p21，CDK2，Smad4mRNA表达

　　TGFβ1目的片断319bp，p21目的片断351bp，CDK2目的片断271bp，Smad4目的片断440bp。pEGFPTGFβ1转染组TGFβ1 24h开始升高，48h达到最高，72h略有减少，96h明显减少，但仍高于正常组，而空载体组与正常细胞组则无明显变化。p21变化趋势和TGFβ1相符，CDK2组变化趋势则正好相反，Smad4组48h明显升高，72h下降明显，96h基本恢复正常(图1AD)。

　　2.2　Westernblot检测TGFβ1，p21，CDK2，Smad4蛋白的表达Westernblot检测结果和RTPCR基本相符（图2AD）。

　　3　讨论
　　
　　细胞周期调控的研究是近年来细胞生物学研究的热点之一，其核心机制为细胞周期蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的活性表达与调控。CDK的激活是依赖于其调节亚基与胞周期蛋白(cyclin)结合形成复合物而发生作用的。而细胞周期蛋白激酶抑制因子(cyclin dependent kinase，CKI)是一组抑制CDK活性的活性因子，这也是CDK活性调节的另一方式[3，4]。在细胞周期调控的过程中，cyclin与CDK结合形成复合物，推动细胞周期的进程，即形成细胞周期的动力系统。不同类型的cyclin/CDK复合物分别调控细胞周期中细胞生长、DNA复制及细胞分裂等重要过程。CKI通过与cyclin/CDK复合物黏附使其失活，导致细胞周期停止，从而阻断细胞的增殖过程，即为细胞周期的制动系统。CKI主要分为两类:（1）Cip和Kip类:包括ｐ21Cip1，ｐ27ｋip1及ｐ57ｋip2。(2）INK类:包括ｐ16INK4，ｐ15INK4Ｂ，ｐ18INK4Ｃ及ｐ19INK4Ｄ。这些类型的CKI主要抑制其相应激酶的活性;CKI过量表达可引起细胞周期的阻断。本实验中TGFβ1的真核表达载体转染晶状体上皮细胞株HLEC后，出现了细胞的生长抑制现象，同时还发现以往被认为是Smad4的下游靶基因的p21在TGFβ1作用后出现了明显增高表达，提示p21参与了该生长抑制过程，可能是通过增高p21的表达来抑制cyclin的作用，令细胞周期停止于G1/S期，同时CDK2的表达亦随时间明显降低。目前已知的TGFβ1的作用机制:上升的TGFβ1能够抑制正常细胞和早期肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡发生。其抑制作用是通过细胞膜上的TGFβRⅠ和TGFβRⅡ将信号传导至细胞质，在受体下游信号分子Smad家族等的参与下，最终抑制细胞生长周期G1/S期过渡实现的。在G1早期，TGFβ1诱导的抑制信号直接作用于原癌基因cmyc；而在G1晚期，TGFβ1可通过抑制CDKs的活性及这些酶的活性周期蛋白，包括cyclinA，cyclinE，cyclinD等，从而抑制S期的开始。TGFβ信号传导基本过程为: TGFβ配体与细胞膜受体结合，激活细胞内Smads蛋白，协同多种转录因子，最终导致目的基因表达。Smads类蛋白是TGFβ信号转导通路中必不可少的中介蛋白，存在于胞质中， Smad4是通用枢纽分子，与上游分子形成核转运复合物后，将信号由胞质传入核内，协同转录因子上调或下调靶基因的表达，因而部分肿瘤由于该通路的缺陷而使肿瘤细胞逃逸了TGFβ的生长抑制作用。Smad4由于其中枢作用而被认为是调控TGFβ信号通路的关键分子，它是TGFβ族各类信号转导过程中共同需要的介质，因此Smad蛋白家族作为TGFβ受体信号传递的关键效应分子，在胞膜信号与基因转录间开通了一条最为简捷的路径。本研究的结果显示随着TGFβ1表达的增加，Smad4在转录和翻译水平均有升高，其高表达具有一定的时间消减性。从而说明TGFβ1的Smad4依赖途径参与LEC的增殖抑制过程[5]。目前的研究已经证明，TGFβ引起的晶状体上皮细胞外基质沉积是通过激活Smad信号通路发生的，Saika等通过免疫组化研究证明在损伤引起的晶状体混浊，MET沉积和PCO中，TGFβ受体激活Smad蛋白，Smad3，Smad3/Smad4结合物出现在细胞核，表明Smad/TGFβ信号途径的激活，同时TGFβ抗体可以阻断Smad3/Smad4的核转位。在Smad3基因敲除鼠和Smad7抑制子转染的人晶状体细胞中，随着Smad信号途径的抑制，损伤引起的细胞外基质沉积也被抑制。由此证明了Smad途径在TGFβ引起的晶状体混浊中起到重要作用[69]。
　　
　　综上所述，TGFβ1在白内障的发生发展过程中的作用是十分复杂的，通过启动凋亡基因p21，改变细胞周期蛋白CDK2，在分子水平抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期于G1/S期。同时TGFβ/Smad经典信号传导途径中最重要的Smad4明显升高，证明TGFβ/Smad途径参与了该生长抑制过程，但其具体机制尚需进一步研究。

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