p53基因与结直肠癌关系的研究进展

【关键词】 p53基因；结直肠癌；基因突变

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤，近几十年以来随着人民生活水平的提高和社会结构老龄化倾向，其发病率有增高趋势，死亡率较高。结直肠癌侵袭转移的发生是导致患者死亡的主要原因，严重危害人类健康。多年来为了探讨其发病机制、早期诊断和有效的治疗方法，人们进行了大量的研究工作，取得了一定的进展。但其发病原因尚未完全清楚。目前较普遍接受的观点是：结直肠癌变的产生是由于癌基因和抑癌基因的协同作用所导致的，正常的结直肠黏膜最初由上皮增生发展成为良性肿瘤，然后恶变成为腺癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，再发展成为转移癌。p53基因是一种抑癌基因，已有众多的临床实验证实p53基因的突变与一些肿瘤的发生密切相关，并且已经证实p53基因突变与p53蛋白的过度表达呈良好的相关性。因此p53基因成为目前研究恶性肿瘤浸润和转移的热点，笔者就p53基因和结直肠癌关系的研究进展做一综述。p53基因的结构和定位　　人类p53基因是位于染色体17p13.1，全长16～20 kb，含有11个外显子和10个内含子，编码393个氨基酸，相对分子质量53 000的核磷酸化蛋白。Wtp53蛋白可分为三部分。第一部分为含转录激活结构域和生长抑制结构域，定位于195Aa的酸性氨基末端，此区也是p53与Mdm2、p14ARF和p300结合的区域。第二个部分是能与特异性识别的DNA序列结合的102292Aa的中央核心区，p53的5个保守序列（BoxIV）有4个位于此区，这4个保守序列是此区功能执行的重要结构。对存在p53基因突变的肿瘤进一步检测发现，97%的p53基因突变集中于中央核心区，其中75%以上为错义突变［1］，突变改变了p53基因的立体结构或影响其与DNA的结合而使p53基因功能丧失。第三部分为300393Aa的碱性羧基末端，含四聚体寡聚化结构域、非特异DNA结合区域及3个核定位信号和1个核输出信号。核写位信号介导p53蛋白定位于胞核内，核输出信号则具有介导p53蛋白从胞核穿梭入胞质的功能。目前研究将p53基因分为野生型（wt p53）和突变型（mt p53）［2］。正常细胞中的p53基因是无突变的野生型p53（wt p53）基因，具有肿瘤生长抑制功能［3］。因wt p53基因含量很少，平均5 000分子/细胞，并且半衰期仅为20分钟左右，难以通过常规免疫组化检测到；而突变型p53基因由于其构象改变且能与一些癌蛋白结合形成复合物；其稳定性增加，半衰期延长，可达2～12小时，细胞内聚集量比正常细胞高出100～1000倍左右。因此，可用免疫组化方法检测出来。一般认为它可基本反应p53基因的突变。p53基因的功能　　1.p53基因与细胞周期调控 细胞周期（cell cycle）是从上次有丝分裂结束开始到下一个有丝分裂结束为止，周而复始的生长过程，并呈现一定的周期性。完整的细胞周期包括DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有丝分裂期（M期），休眠期的细胞（G0期）已经退出细胞周期，但在一定的刺激因素作用下可以重新进入周期进行有丝分裂，是肿瘤复发的根源。调节细胞周期进展的是专一的细胞周期调控点，细胞周期有3个调控点，分别调控G0/G1、G1/S、G2/M［4］。在DNA受损伤后，原核生物和真核生物细胞分裂均延迟，在细胞周期中，从G1/S、G2/M演进的延迟会在大多数机体发生。其中G1期关卡的存在可防止用损伤的DNA作为模板进行DNA复制，允许损伤的DNA在关键的细胞功能发生之前修复，可增加细胞存活时间，限制带有可遗传的基因损伤的细胞增殖［5］。 p53蛋白具有进化保守性，可在DNA复制水平上调节细胞的正常生长，是细胞生长的重要的负调节因子［6］。p53蛋白对于细胞周期的作用是间接的，主要是促进p21基因的转录，增加p21蛋白的合成发挥作用。p21蛋白几乎能与所有的cyclins3/CDKs复合物结合，抑制cyclinsCDKs激酶复合物的活性，使细胞不能通过G1期，因此细胞无法合成DNA。但也有认为p53蛋白可直接与DNA复制机制中的成分如单链结合蛋白增殖细胞核抗原相互作用抑制DNA复制，阻止细胞分裂，使之出现G1期阻滞。

1.p53基因与细胞凋亡

细胞凋亡（cell apoptosis）又称细胞程序性死亡（programmed cell death），是机体内细胞自然死亡的一种生理现象。它与坏死有区别，在形态学上主要表现为染色质沉淀，细胞体积缩小，DNA在核小体间断裂或碎片，形成凋亡小体可迅速被周围的吞噬细胞吞噬。有报道用野生型p53基因及突变的p53基因转染骨肉瘤细胞株，再将转染细胞静脉注射给裸鼠。4个月后，两种转染细胞在肺产生了数目相近的转移瘤，但野生型p53基因转染而产生的转移瘤主要由骨基质及凋亡细胞组成，说明野生型p53基因与细胞凋亡有关［7］。Crighton等［8］研究证实， p53基因通过一种依赖DRAM的放射诱导细胞自我吞噬，并且只有DRAM过表达时才会导致最小限度的细胞凋亡，说明DRAM是p53介导的细胞凋亡的关键因子。Sanding等［9］用腺病毒转染p53基因和p16基因在肿瘤体外培养细胞系中，观察到p53基因过度表达引起肿瘤细胞凋亡。Pan等［10］研究证明，在老鼠的胚胎干细胞中，在肿瘤抑制中起关键作用的p53基因关闭了胚胎干细胞自我更新所必需的基因Nanog，导致胚胎干细胞的分化，关闭细胞自我更新。p53基因突变与结直肠癌的发生　　1.结直肠癌的发病机制 结直肠癌按其发病类型可分为散发性和遗传性两种。散发性结直肠癌大约占结直肠癌的70%，既没有家庭性背景，也没有遗传倾向，多发生于50岁以上，可能与饮食、环境等因素有关。遗传性结直肠癌主要表现为遗传综合征，这类患者有结直肠癌的遗传倾向和家庭聚集性。其遗传综合征包括：以结肠息肉为主要表现，如家庭性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis，FAP）和错构瘤息肉综合征；不以息肉为主要表现，如遗传性非息肉性结直肠癌（hereditay nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC）及癌家族综合征。目前认为结直肠癌发生遵循两条途径：染色体不稳定途径和错配修复途径。①染色体不稳定途径。染色体不稳定途径提出很早，它遵循“正常黏膜腺瘤腺癌”的组织发生顺序。在此途径中染色体的不稳定所导致的癌基因的激活突变和抑癌基因的失活突变（杂合性丢失）引起结直肠癌。以抑癌基因的失活更为重要。APC基因突变是限速步骤，也是最早的步骤。此途径还涉及了p53基因、DCC基因及KRas基因等，主要涉及的是抑癌基因和癌基因。家庭性腺瘤性息肉病（APC基因突变）和大部分散发性结直肠癌是由此途径发生的。p53基因在晚期腺瘤转变为癌的过程中起关键作用。②错配修复途径。错配修复途径的研究开始于1993年。一些研究发现HNPCC患者很少存在p53基因、DCC基因、KRas基因及APC基因的突变，同时又发现HNPCC患者存在着微卫星不稳定。最近研究表明，是由于错配修复系统功能障碍导致的微卫星不稳定。HNPCC患者和15%～20%的散发性结直肠癌存在微卫星不稳定，但两者机制不同。HNPCC遵循“腺瘤腺癌”的组织发生顺序，但癌变率高，癌变时间短。早期形态改变为异常隐窝病灶（ACF）。微卫星不稳定阳性的散发性结直肠癌并不遵循传统的“腺瘤腺癌”的组织发生顺序，是由锯齿状腺瘤发展而来［11］。两者的发生机制也不相同。HNPCC是由错配修复基因突变引起的，而微卫星不稳定阳性的散发性结直肠癌很少发生错配修复基因突变，而是由hMLH1基因启动子的甲基化所导致的hMLH1基因的沉默表达引起的。

2.p53基因突变

结直肠癌的发生与其他疾病的发生一样，受遗传、环境、社会、行为习惯等各方面影响，然而已有众多的临床实验证实p53的突变与一些肿瘤的发生密切相关，尤其结肠癌。并且已经证实p53突变与p53蛋白过度表达呈良好的相关性［12］。结直肠癌发生时p53的突变和表达：正常胃肠黏膜均为阴性表达。有实验表明［13］，分化良好的腺瘤，包括家庭性多发性结肠息肉这一常染色体显性遗传病以及结直肠息肉中p53的表达明显低于结直肠癌，这一结果支持p53基因突变在结直肠癌的发生中起重要作用的论点。另外，ELDeiry WS等［14］研究表明野生型p53能够诱导p21表达。引起多种肿瘤细胞的生长抑制，而突变p53则无此作用，同样，徐文怀等研究表明p53与p21在结直肠癌中的表达无直接相关性。通常在结直肠癌的发生过程中，可经历如下几个阶段：正常黏膜、腺瘤、结直肠癌、转移病灶。众多的实验表明正常黏膜p53表达为阴性，然而有研究表明腺瘤阶段p53基因就有可能发生突变，并且未随肿瘤的发生发展而进一步增高。结直肠癌发生过程中p53基因突变率在比较高的水平，大约50%～80%之间，且主要发生在第5～8外显子上，并且有研究表明p53基因突变与腺瘤及腺癌的组织学类型无关。因此，检测p53表达状况有利于预测腺瘤癌变倾向、p53基因蛋白产物的检测已成为结直肠癌早期诊断的重要手段之一。p53基因与结直肠癌转移及预后　　结直肠癌的预后除了与分期、分化程度、治疗方法等因素有关外。同时众多原癌基因的激活和肿瘤抑制基因的突变和（或）失活都起重要作用。对于p53基因与结直肠癌预后的关系各文献报道不一致。国外资料报道p53蛋白细胞核高表达状态，可作为结直肠癌患者预后的重要生物学标记。Okubo等［15］检查了110例结直肠癌患者，发现p53过度表达和变异均与生存相关。而且在远端结直肠癌的危险性更高，同时p53表达对远、近侧结直肠癌预后判断的作用是有差异的。沈岚等［16］研究结直肠癌p53表达与淋巴结中心增生（GH）关系中发现p53强阳性表达组GH增生减弱，淋巴结转移率高，预后差。Goh等［17］报道187例结直肠癌转移组p53基因突变率为70%，而无转移组为43%。认为p53基因突变与结直肠癌转移潜能有关。Yamagnchi等［18］报道p53表达与结直肠癌的肝转移有关。在Dukes’c期中p53阳性患者5年生存率低于p53阴性组。因而认为这可能与p53阳性者有较高的增殖活性有关。而有些学者则认为p53是否表达与结直肠癌预后无关。邹扬等［19］对307例结直肠癌标本进行检测p53阳性表达57.98%，随访219例病人6～30个月，在p53表达阳性的肿瘤复发率为17.24%，p53表达阴性者复发率为15.56%，两者比较差异无显著性（P＞0.05）。刘小方等［20］研究亦表明p53基因突变与患者性别、肿瘤大体类型、组织学分类、细胞分化、病理分期等均无明显关系。邓海军等［21］采用PCRSSCP和免疫组织化学方法，检测68例直肠癌远侧癌旁黏膜p53基因突变及p53蛋白表达情况，结果26.47%直肠癌远侧癌旁黏膜存在p53基因突变，23.53%直肠癌远侧癌旁黏膜存在p53蛋白表达，而直肠癌远侧癌旁黏膜p53基因突变及其蛋白表达与直肠癌临床病理学特征无相关性。Gallego等［22］检测了126例术后5年的患者，发现p53过度表达与预后无关，与临床病理上的变化不同，无论单因素分析还是多因素分析，p53表达与局部控制、无病生存或全组生存率在统计学上无显著相关（P值分别为0.91、0.18、0.17）。恶性肿瘤预后与淋巴结是否转移有密切的联系，结直肠癌也不例外。但是对于p53基因在结直肠癌发生淋巴道转移过程中是否起作用，观点亦不一致。Hayashi等［23］分析了120例结直肠癌区域淋巴结的p53基因的突变情况及预后，术后随诊观察中有40%～70%的p53阳性患者发生局部复发和区域淋巴结转移，而p53阴性患者无一发生复发、转移。李强等［24］的研究表明p53的过度表达与大肠癌的分化程度、浸润深度、肿瘤直径无关（P＞0.05），仅与其淋巴结转移显著相关（P＜0.05）。Manguila等［25］则认为p53表达与淋巴转移无关。邓昊等［26］用免疫组化法（D007）检查结直肠癌标本74例，经溶脂法检查淋巴结共3503枚，全组中31例有p53过度表达，认为p53过度表达与结直肠癌淋巴结转移、微转移程度无明显相关性。p53基因治疗结直肠癌　　由于p53基因突变率高，恢复肿瘤细胞中的野生型p53（wt p53）的功能成为p53抑癌基因治疗的首要途径。大量体外培养细胞和动物模型都证实了外源的wt p53导入后，肿瘤细胞增殖减慢，细胞发生凋亡，瘤体体积缩小，对放、化疗药物的敏感性增高。Okimoto等［27］经肝动脉给RCN9结肠癌肝转移大鼠注入腺病毒介导的p53基因，48 h后，顺铂（3 mg/kg）被注入大鼠腹膜腔，一段时间后，发现肝转移癌细胞广泛死亡，而肝功能没有一点损害。Cook等［28］发现，氧化亚氮能够促进p53依赖性细胞凋亡。通过转移一氧化氮合酶基因到结肠癌细胞内，诱导一氧化氮生成，使得p53基因15位丝氨酸磷酸化增加，从而激活p53基因，显著抑制肿瘤生长。目前结直肠癌基因治疗已经从基础理论阶段进入临床试验，而选择安全有效的转移载体是关键。目前国内外研究最多，发展最快的是以腺病毒和脂质体为载体。用重组腺病毒介导的p53基因治疗肿瘤，能够诱导肿瘤内部野生型p53基因，从而抑制肿瘤细胞增殖。利用p53基因治疗肿瘤临床试验已经开展，初步结果已经证明直接瘤内注射这类载体的安全性，并且证实即使在机体内出现抗腺病毒免疫反应时p53基因也能够表达。Ⅰ期临床试验已经评估了经肝动脉一次性给予腺病毒介导的p53基因治疗结肠癌肝转移的安全性和有效性。最大剂量达到2.5×1012病毒颗粒时患者仍然可以耐受，副作用是患者出现类似流行性感冒的症状。16例患者中4例出现一过性的转氨酶升高［29］。

　　综上所述，影响结直肠癌预后的因素是复杂的，p53基因突变或高表达也许只是其中的一个方面，况且p53基因突变又是突变位点多、范围广，p53基因对结直肠癌淋巴道转移及预后的价值目前尚有争议，有关p53基因对于结直肠癌预后的影响有待更深入的研究。

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