作者：常正义，覃志坚，潘云，吴惠珍，马迎教，罗斌，陆小婵
【摘要】 目的 探讨不同亚型人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈病变的关系。方法 对细胞学筛查为异常并经病理组织学证实的524例宫颈病变（包括宫颈炎251例、CINⅠ 130例、CINⅡ 67例、CIN Ⅲ 61例及ICC 15例）进行HPV分型检测。结果 ①HPV总阳性率为55.53%(291/524)，HPV感染率随着宫颈病变级别的增加逐渐上升(P&<0.01)，HPV感染在不同年龄组差异有高度显著性（P&<0.01），21～50岁系高发年龄。②检出20种HPV亚型，其中高危型16种，低危型4种，随宫颈病变程度的增加HPV亚型分布有所变化，宫颈炎组以HPV16、58、18、11、31、33、6为常见亚型，低度病变组（CIN Ⅰ）以HPV16、58、18、31、56、11、33为常见类型，而高度病变组（CIN Ⅱ～Ⅲ）以高危型HPV16、58、18、31、33、59和56型为最常见，15例浸润癌检出7种高危亚型HPV，分别是16、58、18、31、33、59和68型。HPV16亚型随宫颈病变级别加重感染率呈上升趋势(P&<0.01)。结论 感染率最高的高危型HPV16、58、18、31、33是主要致病基因型，尤其是HPV16型与宫颈病变程度有关，高危型HPV持续感染及多重感染是导致宫颈癌变的主要原因之一。
【关键词】 人乳头瘤病毒；基因型；宫颈疾病
Abstract: Objective The association of various subtype human papillovirus (HPV) infection with precancerous lesions of uterine cervix are investigated. Methods HPV typing test was performed for 524 cases with precancerous lesions of uterine cervix proven by cytological examination and histopathological examination， including 251 cases of cervicitis， 130 cases of cervical intraepithelial neoplasia Ⅰ (CIN Ⅰ)， 67 cases of CIN Ⅱ， 61 cases of CIN Ⅲ and 15 cases of infiltrating cervix cancer (ICC). Results 1. Of 524 patients， 291 of them (55.53%) were found with HPV-positive， the higher grade of lesions of uterine cervix was， the more the infection rate was (P&<0.01). The infection rate differed significantly among various age groups (P&<0.01)， the highest risk age was from 21 to 50 years. 2.20 subtypes of HPV were isolated， 16 of them was high risk type， 4 of them was low risk type. The HPV subtype varied with severity of cervix diseases increased， cervicitis group presented with HPV16， 58， 11， 31， 33 and 6; low grade of uterine cervix lesion group (CIN Ⅰ) commonly presented with HPV 16， 58， 18， 31， 56， 11 and 33， and high grade lesion group (CIN Ⅱ～Ⅲ) were found with high risk type HPV 16， 58， 18， 31， 33， 59 and 56. 7 types of high risk HPV were found in 15 cases with ICC， including types 16， 58， 18， 31， 33， 59 and 68. HPV16 subtype increased significantly with higher grade of the cervix lesions (P&<0.01). Conclusion The highest infected HPVof high risk types 16， 58， 18， 31 and 33 were the major pathogen， HPV16 was especially correlated with cervix disease severity， continuous high risk HPV infection and multi-infection results in cervix canceration.
Key words: human papillovirus; genotype; cervix diseases
近年来流行病学研究发现，宫颈癌有年轻化趋势，主要与人乳头瘤病毒(HPV)感染有关。迄今已发现HPV有100多种基因型，不同型别引起细胞病理变化的类型不同，分为高危型和低危型［1］。低危型HPV常在宫颈良性或低度病变的病灶中检测到，而高危型HPV通常在高度病变及宫颈癌中发现。从宫颈上皮内瘤变(CIN)发展到宫颈癌是一个较长的过程，因此及早发现高危型HPV感染和及早治疗CIN患者以阻断宫颈癌的发生，是当前医学预防和研究的重点之一。本研究通过对宫颈炎、CIN及宫颈浸润癌(ICC)中HPV感染情况，探讨不同型别HPV感染与宫颈病变的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择在本院妇科门诊就诊及住院病人，经液基细胞学筛查异常且经病理组织学检查证实的宫颈炎251例，低度宫颈上皮内瘤变（CINⅠ）130例，高度宫颈上皮内瘤变128例（CIN Ⅱ67例、 CIN Ⅲ 61例）及ICC 15例（鳞状细胞癌13例、腺癌2例）为研究对象，年龄21～68岁，平均35.6岁。524例均进行HPV基因分型检测。
1.2 研究方法
1.2.1 宫颈液基细胞学检查
采用塑料颈管刷分别收集宫颈外口和颈管的脱落细胞，将塑料颈管刷在盛有Thinprep细胞保存液小瓶中涮10圈，保存液中的标本经Thinprep 2000系统处理(将标本中的黏液、血液和炎细胞与上皮细胞分离，经精密度滤器过滤后转移到静电处理过的载玻片上)，制成直径为2cm的薄层细胞涂片，用95%酒精固定，巴氏染色。诊断标准采用2001年国际癌症协会TBS诊断系统［2］。即根据细胞异型性的严重程度依次诊断为正常范围(WNL)，意义不明的不典型鳞状细胞(ASCUS)，低度鳞状上皮内病变(LSIL)，高度鳞状上皮内病变(HSIL)，鳞状细胞癌(SCC)和腺癌。细胞学诊断HPV感染的标准是：核周空穴细胞、角化不良细胞和湿疣外底层细胞［2］。HPV感染细胞在涂片主要表现为中表层异形核出现典型厚壁大空穴细胞、角化不良细胞和湿疣外底层细胞，空穴细胞核不规则，深染呈墨滴状，常见双核或多核，角化不良细胞在巴氏染色中胞浆成桔黄色，核形不规则深染，片状出现或散在单个细胞，湿样外底层细胞胞浆多彩核增大，染色质污秽状，按TBS方案，核周空穴细胞(亦称挖空细胞)明显则明确为HPV感染，如仅见角化不良细胞和(或)不典型空穴细胞，仅提示可能为湿疣病变。
1.2.2 宫颈组织病理学诊断
对液基细胞学检查异常组妇女进行阴道镜检查，于镜下先观察上皮及血管，然后涂3%醋酸3 min后观察上皮血管，在阴道镜图像异常区及碘试验阴性区多点取活检，如为正常转化区，则在转化区3、6、9、12点取活检。按《病理学》诊断标准［3］，根据细胞异型性的程度和范围依次分为宫颈炎，CIN(CINⅠ、CINⅡ、CIN Ⅲ)，宫颈SCC和腺癌，其中CINⅠ相当于细胞学诊断的LSIL，CINⅡ和CIN Ⅲ相当于细胞学诊断的HSIL。
1.2.3 HPV基因分型检测
对细胞学和组织学诊断为宫颈炎、CIN及宫颈癌的524例患者进行HPV分型检测，将剩余在Thinprep细胞保存液小瓶中的标本移入1.5ml微量离心管中，13 000r/min离心10min，弃去上清，保留管底的细胞块。加入50μl裂解液悬浮沉淀，100℃水浴加热10min，13 000r/min离心10min，取上清液进行PCR扩增、杂交、洗膜及显色。HPV分型一次检测：6、11、42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4等23种基因型。结果判断：倒去显色液，用清水冲洗一次膜条，肉眼观察检测结果，HPV单一感染时，在膜芯片上相应HPV亚型探针位点处可见到一个蓝色斑点，双重或多重感染时在膜芯片上可见到两个或两个以上的显色斑点。HPV分型基因芯片试剂盒购自深圳亚能生物技术有限公司。本研究病例中检出20种HPV亚型，检出率在5.00%以上者定为常见亚型［4］。
1.3 统计学处理
采用趋势χ2检验、χ2检验。
2 结果
2.1 宫颈病变HPV感染与年龄分布
应用基因芯片技术检测524例宫颈病变标本HPV总阳性率为55.53%(291/524)，在宫颈炎组、CINⅠ、CINⅡ、CIN Ⅲ及ICC组中HPV感染率分别为31.08%（78/251）、66.15%（86/130）、82.09%（55/67）、93.44%（57/61）、100.00%（15/15），感染率随着宫颈病变级别增加而逐渐上升（χ2趋势=123.00，P&<0.01）。HPV感染与年龄分布经统计学分析发现，不同年龄组之间差异有高度显著性（χ2=30.95，P&<0.01），宫颈病变HPV感染主要集中在21～68岁之间，其中21～50岁系高发年龄，占61.65%（246/399），见表1。表1 宫颈病变HPV感染与年龄分布（略）
2.2 不同型别HPV在宫颈病变的分布
由于存在着多重感染，291例HPV感染的宫颈病变标本中检出亚型次数为380，检出20种HPV亚型，其中包括4种低危型（HPV6、11、42、43）和16种高危型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73、83）。常见亚型是HPV16、58、18、31、33、11和59型7种，其余亚型为HPV56、68、6、52、66、51、73、39、45、35、42、83和43型。在宫颈炎组中检出16种HPV亚型，以HPV16、58、18、11、31、33和6为最常见；随着病变程度的增加，HPV亚型分布有所变化，在CIN病变组中高危型HPV检出率有所增加，而低危型HPV检出率逐渐下降，低度病变组（CINⅠ）以HPV16、58、18、31、56、11和33为常见类型，而高度病变组（CINⅡ～Ⅲ）以高危型HPV16、58、18、31、33、59和56为最常见；15例浸润癌共检出7种高危亚型HPV，它们分别是HPV16、18、58、31、33、59和68。在检出的20种HPV亚型中，HPV16亚型与病变程度有关，其检出率随着宫颈病变级别的增加而逐渐上升（χ2趋势=32.10，P&<0.01），见表2。表2 不同型别HPV在宫颈病变的分布（略)注，a：χ2趋势32.10，P&<0.01
3 讨论
3.1 宫颈病变HPV感染与年龄分布
应用基因芯片技术检测524例标本，HPV总阳性率为55.53%。通过本研究发现，随着宫颈病变级别的增加，HPV阳性率逐渐升高，从宫颈炎组的31.07%上升到ICC组的100.00%（P&<0.01），结果与大多数文献报道的结果相一致［4～6］。由此可见，HPV感染与宫颈病变有很大的关系，说明HPV阳性强烈预示着CIN和ICC的存在，而HSIL和ICC发病年龄呈现年轻化的趋势，也可能与HPV的广泛存在有关。本研究结果，在细胞学及病理组织学诊断的宫颈炎、CIN和ICC患者中，有31.07%的宫颈炎、66.15%的LSIL（CINI）、87.50%的HSIL（CINⅡ～Ⅲ）和100.00%的ICC检测到HPV基因型。HPV感染与年龄分布经统计学分析，不同年龄组之间差异有高度显著性（P&<0.01），HPV感染主要集中在21～68岁之间，其中21～50岁系高发年龄，占61.65%（246/399）。有文献报道［7］，初次性交年龄过小、男方或女方多个性伴侣、免疫力低下及宫颈慢性炎症等良性疾病被认为是宫颈癌的重要危险因素，HPV感染与男女性混乱有关，且随着性伴侣数的增加而呈趋势性增高。初次性交年龄过早和多个性伴侣在理论上可能不是真正独立的危险因素，但妇女性生活过早及多个性伴侣，就可能接触与性生活有关的致病原、致癌原时间更长、更频繁，这提示宫颈更易遭受潜在性致病原或致癌原的侵犯。本组资料显示，21～50岁年龄段的育龄妇女是宫颈病变HPV感染的高发期，最易受宫颈病变危害。因此，对育龄妇女进行宫颈阴道细胞学检查和HPV筛查，增强妇女性道德、性卫生保健意识，能有效地减轻宫颈病变对妇女的危害，让更多的年轻宫颈病变患者得以早期发现和诊治。
3.2 HPV感染型别与宫颈病变的关系
HPV有近100多种亚型，约40种与肛门生殖道感染有关，根据在宫颈癌发生中的危险性不同，分为高危型和低危型［1］，而且不同HPV亚型的感染其致病性和后果也有差异［8］，低危型HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81等主要引起生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和LSIL；高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82等主要导致HSIL和宫颈癌的发生。本研究应用基因芯片对HPV感染的病例标本进行检测，检出4种低危型和16种高危型HPV，宫颈炎组中检出16种HPV亚型，4种低危型均被检出，并检出12种高危亚型，以HPV16、58、18、11、31、33和6型为最常见；随着宫颈病变程度的增加HPV亚型分布有所变化，在CIN病变组中高危型HPV检出率有所增加，而低危型HPV检出率逐渐下降，低度病变组（CIN Ⅰ）以HPV16、58、18、31、56、11和33为常见类型；而高度病变组（CINⅡ～Ⅲ）以高危型HPV16、58、18、31、33、59和56型为最常见。15例宫颈浸润癌共检出7种高危亚型HPV，分别是HPV16、58、18、31、33、59和68型。虽然各级别病变间感染型别存在差异，但高危型HPV16、58、18、31、33在各级别病变组均占有一定优势，提示上述型别具有较高致病性，尤其是感染率最高的HPV16随宫颈病变级别增高其感染率明显上升，在宫颈炎和低度病变组分别为20.51%和34.88%，而在高度病变组和宫颈癌组的感染率高达54.46%和73.33%，组间差异有高度显著性（P&<0.01），说明HPV16致癌性更强。由此可见，HPV基因型与宫颈病变程度明显有关，特别是高危型HPV16、58、18、31、33型的持续性感染是导致宫颈癌发生的最主要原因之一。这也与文献［9～11］报道的结果相一致。
参考文献
［1］Dell G， Gaston K. Human papillo maviruses and their role in cervical cancer ［J］. Cell Mol Life Sei，2001，58(12-13):1923-1942.
［2］刘树范.宫颈细胞病理学报告方式(2001年TBS术语学)及诊断标准［J］.癌症进展，2004，2(1):64-69.
［3］杨光华.病理学［M］.5版.北京:人民卫生出版社，2001:275-310.
［4］谢静，乔惠珍，王琳，等.人乳头瘤病毒感染与宫颈癌前病变和宫颈癌关系的研究［J］.内蒙古医学杂志， 2005，37(2):118-121.
［5］吴玉萍，陈裕隆，李隆玉，等.宫颈癌患者人乳头瘤病毒(HPV)主要型别及其感染研究［J］.病毒学报，2005，21(4):269-272.
［6］洪蝶，吕卫国，叶枫，等.宫颈癌及上皮内瘤变人乳头瘤病毒基因型的检测［J］.现代妇产科进展，2006，15(1):36-38.
［7］戎寿德，陈汶，吴令英，等.山西省襄垣县宫颈癌危险因素分析［J］.中华预防医学杂志，2002，36(1):41-43.
［8］Clifford GM， Smith JS， Plummer M， et al. Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta-analysis ［J］. Br J Cancer，2003，88(1):63-73.
［9］乌兰娜，吴瑞芳，周艳秋，等.人乳头瘤病毒基因亚型与宫颈病变的关系［J］.中国妇产科临床杂志，2005，6(5):346-350.
［10］Bachtiary B， Obermair A， Dreier B， et al. Impact of multiple HPV infection on response to treatment and survival in patients receiving radical radiotherapy for cervical cancer ［J］. Int J Cancer，2002，102(3):237-243.
［11］Lee SA， Kang D， Seo SS， et al. Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPV DNA chip ［J］. Cancer Lett，2003，198(2):187-192.