四氢生物蝶呤对高胆固醇血症所致血管内皮细胞功能异常的转复机制探讨

【摘要】 研究高胆固醇血症兔的血管内皮功能的异常状况及四氢生物喋呤(BH4)的转复机制。方法:18只新西兰兔，随机分为正常饮食组、高胆固醇饮食组、BH4加高胆固醇饮食组。喂养5周后，测定血中总胆固醇、一氧化氮(NO)及丙二醛水平，并取主动脉，进行离体血管舒张功能实验，测定不同条件下，血管条对乙酰胆碱的舒张反应。结果:与正常饮食组比较各胆固醇喂养组血清总胆固醇明显增高，有极显著性差异(P&<0.01 )。高胆固醇饮食组与正常饮食组比较血中NO水平明显减低(Ｐ&<0.01 )， 丙二醛浓度明显升高(Ｐ&<0.01 ); BH4加高胆固醇饮食组与高胆固醇饮食组比较NO水平明显升高(Ｐ&<0.05)，而丙二醛的水平较高胆固醇饮食组明显降低。不同组别的动脉对乙酰胆碱最大舒张功能存在明显差别，高胆固醇饮食组的舒张功能较其他组明显下降; BH4加高胆固醇饮食组的舒张功能，较高胆固醇组明显恢复。结论：高胆固醇血症导致血管内皮细胞舒张功能障碍，BH4对其具有转复作用，其转复机制可能与BH4升高血液中的NO和降低过氧化物的水平有关。

【关键词】 四氢生物蝶呤；高胆固醇血症；内皮细胞功能；一氧化氮；丙二醛

血管内皮细胞处于血液与组织的界面，具有调节血管张力、血管生长与炎症免疫反应，维持凝血纤溶平衡，充当物理与化学屏障等多种功能。高血压、糖尿病、长期吸烟等多种危险因素均可导致血管内皮功能异常，其突出表现为内皮依赖性血管舒张功能受损，这种舒张障碍既可发生在大动脉如颈动脉，也可发生在微小动脉如冠状阻力动脉[1]。研究表明，血管内皮功能异常主要与一氧化氮( nitric oxide， NO) 水平下降以及氧自由基如超氧阴离子增加相关。NO主要由血管内皮细胞合成，源自底物左旋精氨酸(Larginine， LArg)，在NO 合酶(nitric oxide synthase， NOS)的作用下产生[2]。 四氢生物蝶呤（Tetrahydrobiopterin， BH4) 则是NOS 作用的重要辅助因子。近年研究发现， BH4 与血管内皮功能密切关联。缺乏BH4将导致血管内皮功能的异常[3]。内皮细胞功能异常与动脉粥样硬化密切相关。由于高胆固醇血症是动脉粥样硬化的主要危险因素之一，本课题旨在探讨高脂血症家兔的内皮细胞功能及其BH4对其产生的影响和机制。

1 材料与方法

　　1.1药品BH4购自美国Sigma公司(每支100mg)。

　　1.2实验分组选用6月龄18只新西兰纯种雄性白兔，体重2～2.5 kg。随机分为3组:对照组(进食普通饲料)、高胆固醇饮食组、BH4加高胆固醇饮食组。动物于实验前先作一周的适应性喂养。一周后，高胆固醇饮食组和BH4加高胆固醇饮食组每日每只添加胆固醇15 g。所有实验动物均限食量，每只每日200 g，自由饮水，共喂养5周。BH4加高胆固醇饮食组动物在喂养最后一周耳缘静脉注BH4 10 mg·kg1，隔日一次，共三次；对照组耳缘静脉注射相等容量的生理盐水。

　　1.3测定方法血清总胆固醇的测定：心脏穿刺取血，3000转/分离心后取血清，用日立7170型全自动生化分析仪检测。NO水平测定：酶法测定NO (nitric oxide ， NO)终产物NO2， NO试剂盒由北京晶美生物工程有限公司提供。丙二醛浓度测定：以硫代巴比妥酸反应物质(thiobarituric acid reactive substance TBARS)法[4]测定血液中脂质过氧化终产物丙二醛 (malondialdehyde，ＭＤＡ)含量， 间接反映血液中过氧化物的水平，结果以μmol·L-1硫代巴比妥酸反应物质表示。动脉舒张功能测定: 动物处死后， 取主动脉制备长约4 cm的环行标本。将标本沐于37℃盛有台式液的恒温浴槽中， 通过机械电换能器与BL410生物机能实验系统连接， 用来记录血管条张力变化。定标后，测定血管条基础张力为98×10-3N。给予乙酰胆碱1.0×1 0-5～3.0×1 0-5mol·L-1， 至血管舒张达最大限度时，记录血管的张力。

　　1.4统计学处理：各组计量资料以x±s 表示， 应用SPSS10.0 软件进行统计学分析， 两组间比较采用t 检验， P＜0.05有显著性差异。

2 结果

　　2.1 血脂、NO及丙二醛水平变化结果见表1，动物喂养5周后，与正常饮食组比较，高胆固醇饮食组及BH4加高胆固醇饮食组血清总胆固醇明显增高， 有极显著性差异(Ｐ&<0.01 )。同时测定NO显示，高胆固醇饮食组较正常饮食组NO水平明显减低， 有极显著性差异 (Ｐ&<0.01 ); 血液中丙二醛的间接测量指标TBRS的含量较正常饮食组明显增高(Ｐ&<0.01 )，而BH4加高胆固醇饮食组和高胆固醇饮食组比较TBRS的含量明显下降(Ｐ&<0.01 )。 表1 四氢生物蝶呤对兔血脂、NO及丙二醛水平变化注：与对照组比较*P＜0.01；与高胆固醇饮食组比较 △P＜0.012.2动脉对乙酰胆碱的最大舒张功能

　　各处理组较对照组血管对乙酰胆碱的最大舒张功能均明显下降，其中高胆固醇饮食组的下降更为明显；两处理组比较，BH4加高胆固醇饮食组血管对乙酰胆碱的最大舒张功能明显升高。表2 四氢生物蝶呤对不同浓度乙酰胆碱的最大舒张功能注：与对照组比较*P&<0.05，**P&<0.01;与高胆固醇饮食组比较 △P＜0.013讨论

　　实验证明，高胆固醇血症是动脉粥样硬化的主要危险因素之一，而血管内皮功能异常的可能是高脂血症导致动脉粥样硬化发生的重要机制。血管内皮的功能异常主要表现为内皮依赖性的血管舒张功能障碍，后者又进一步导致内皮下脂质沉积，动脉粥样斑块形成，产生冠心病或缺血性脑病。这种内皮依赖性的血管舒张功能障碍，可被BH4所拮抗。本实验使用高脂饮食喂养兔，建立高胆固醇血症模型。实验中胆固醇喂养组动物总胆固醇较正常饮食组明显升高(Ｐ&<0.01 )，可以认为高胆固醇血症模型建立成功。高胆固醇血症兔的血管内皮舒张功能较对照组明显减低，而使用BH4加高胆固醇饮食组的血管对乙酰胆碱的最大舒张功能，较单纯的高胆固醇饮食组明显升高，说明BH4对喂养胆固醇引起的血管舒张功能障碍，具有明显的转复作用。而BH4加高胆固醇饮食组胆固醇含量较对照组并未发生明显降低，说明BH4对血管内皮功能的改善并非通过降低血液中的胆固醇含量引起的，可能是通过其他的机制。

　　血管内皮细胞释放的血管活性物质如NO、前列环素、内皮超极化因子等具有调整血管张力、维持血管壁正常舒缩功能的作用。乙酰胆碱诱导的舒血管反应由NO介导，当血管功能受损时乙酰胆碱诱导的心外膜及阻力血管舒张反应即出现异常[5]。由于BH4是一氧化氮合酶（NOS）重要的辅酶，它催化NO的合成，而NO具有舒血管的作用。本实验通过检测NO的浓度，发现高胆固醇血症的兔血液中NO的浓度，较对照组明显降低，而使用BH4后NO的浓度又得以恢复，说明BH4引起的血管舒张功能的改善可能是通过恢复血液中NO的浓度实现的。Zeiher等[6]报道乙酰胆碱诱导的血管舒张功能减低与动脉粥样硬化管壁厚度具有相关性。Ueda等[7]研究证实BH4的作用可被NOS内源性抑制剂Ｌ甲基精氨酸抑制， 说明BH4改善内皮功能是通过介导Ｌ精氨酸NO旁路来实现的。既然高胆固醇血症已造成血管内皮功能的失常，这种失常也发生在动脉粥样硬化。血管内皮功能的失常可能诱发动脉粥样硬化，而血管内皮功能失常的原因之一可能就是高胆固醇血症。因此临床上治疗高胆固醇血症对预防动脉粥样硬化具有重要的意义。

　　BH4 引起的NO浓度的降低常伴随血液中过氧化物浓度的增高。当BH4 水平下降或生物利用度降低时， NOS 的作用不是产生NO， 而是产生超氧阴离子， 同时造成NO减少与氧自由基增加，最终导致血管内皮功能异常。但是否与血管内皮功能减退有关尚有待进一步的研究。血脂增高可引起ＢＨ4含量绝对或相对减低，这一方面是由于氧自由基生成增多造成细胞内氧化应激状态[8]，而ＢＨ4在细胞内的合成有赖于正常的氧化还原环境; 另一方面，NOS活性上调， 导致BH4活性相对降低。本实验高胆固醇血症兔的血液中，脂质过氧化最终代谢产物丙二醛的间接测量指标TBRS浓度明显升高，说明在高胆固醇血症，体内过氧化物的浓度升高，而后者是导致动脉粥样硬化和血管内皮细胞舒张功能障碍的原因之一。而使用BH4后高胆固醇血症引起的TBRS浓度升高可以被抑制。进一步说明体液中的BH4水平可能影响血管内皮细胞功能，异常的BH4水平可能导致动脉粥样硬化的发生。

　　保护血管内皮对维护心血管系统健康有着关键意义。血管内皮功能异常既是动脉粥样硬化、高血压、心肌梗塞、心血管重塑等心脑血管疾病发生的始动因素， 也是加速疾病发展的因素， 并且是疾病损伤的靶器官。虽然血管内皮功能的重要性已被认识， 但寻求高效、安全、简便、经济的方法防治内皮功能障碍仍是长期的工作，目前的措施主要包括: 有抗氧化剂、他汀类调脂药、血管紧张素转换酶抑制剂、提供酶底物等。对BH4 生物学行为的揭示，无疑为防治内皮功能异常提供了新思路。

参考文献

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