葛根素β环糊精包合物小鼠血浆中生物利用度研究

　　 作者：廖昌军 曹丽萍 高秀蓉 钟元高 谢佳 宋波 赖小利 蓝艳丽 袁前文

【摘要】 目的：研究葛根素β环糊精包合物与葛根素原料药口服灌胃后小鼠体内的生物利用度。方法：采用HPLC测定小鼠血中葛根素浓度，药时曲线数据用DAS2.1.1版药动学分析软件处理。结果：葛根素在小鼠体内药动学过程符合二室模型，葛根素原料药的AUC、Cmax和Tmax分别为1657.28 mg·L-1·min-1、26.34 mg·L-1和30min，而葛根素β环糊精包合物的AUC、Cmax和Tmax分别为3504.30 mg·L-1·min、77.34 mg·L-1和30min，统计结果表明AUC之间有显著性差异。结论：葛根素进行β环糊精包合后可以提高葛根素的口服生物利用度。

【关键词】 葛根素;β环糊精;生物利用度

葛根素(Puerarin)是葛根的主要活性成分之一，具有扩张冠状动脉及脑血管、降低心肌耗氧量、改善微循环的作用，是临床心血管疾病的治疗药物之一[1] 。由于葛根素中具多苯环和多羟基的结构，溶解性较差，难以被胃肠道等生物膜吸收，口服生物利用度小于15%[2，3]。目前仅有注射液用于临床，但其不能自主给药，因而限制葛根素的临床应用。β环糊精作为药物载体，通过包合作用能促进药物的口服吸收[4]。本文通过对葛根素原料药和葛根素β环糊精包合物在小鼠体内口服相对生物利用度进行研究，考察通过包合作用是否能促进药物的口服吸收。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与药品

　　高效液相色谱仪包括P680双泵、ASI100自动进样器、TCC100柱温箱和UVD170U型紫外检测器(美国Dionex公司);TGL16G型离心机(上海安亭科学仪器);XW-80A旋涡混合器(上海青浦泸西仪器厂)。

　　葛根素对照品(中国药品生物制品检定所，纯度&>99%，批号：0752-200608);葛根素原料药(成都天源天然产物有限公司，批号：20070915);甲醇为色谱纯;水为双蒸水(自制);其它试剂均为分析纯。

　　1.2 实验对象及分组处理

　　昆明成年小鼠，雌雄各半，体重为20±2g，采用随机分组方法分成葛根素原料药对照组和β环糊精包合物试验组，每组设10个采样时间点，每个时间点5只小鼠，禁食12h后，分别将葛根素原料药和β环糊精包合物定量称取后加入到水、乙醇和聚乙二醇制成的混悬液中，按0.2g·kg-1给小鼠灌胃，灌胃后分别于5、10、30、60、90、120、150、180、240、300min时断头采血0.5ml，-24℃保存。

　　1.3 色谱条件

　　C18柱(4.6×150nm，5μm);流动相:甲醇-1%乙酸(25:75);流速:1ml·min-1;柱温：25℃;检测波长250nm。

　　1.4 血浆样品的处理

　　取血样0.5ml，3600r·min-1×5min离心后取上清液0.2ml，加入甲醇溶液0.8ml，漩涡振荡3min，放置5min，再漩涡振荡2min，10000r·min-1×10min离心，取上清液氮气挥干，残渣用0.3ml甲醇溶解，10000r·min-1×10min离心，取上清液20μl进样测定。

　　1.5 统计学处理

　　对主要药动学参数AUC和Cmax进行双单侧t检验和Tmax进行非参数检验。数据以X±s表示，P&<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 方法专属性

　　按“1.3”项下色谱条件及“1.4”项下样品处理方法，分别取20μl空白血浆、PU对照品加空白血浆和葛根素的血浆样品进样测定，HPLC图谱如图1，由图1可知，血浆中其它成分对葛根素的测定没有干扰。

　　图1 葛根素的血浆样品HPLC图谱

　　注：空白血浆样品(A)、空白血浆+葛根素对照品(B)和葛根素血浆样品(C)HPLC色谱图。B、C图中所标注“1”为葛根素的峰。

　　2.2 葛根素血浆样品标准曲线制备

　　精密称取干燥至恒重的葛根素对照品，配制成浓度为100μg·ml-1的标准溶液。取0.2ml空白血浆10份，分别加入上述标准溶液和甲醇，得到浓度为80、50、40、30、25、20、10、5、2.5、1.25μg·ml-1的系列标准血样。按1.4项方法处理后，分别取上清液20μl进样，测定葛根素的峰面积，并以葛根素峰面积对葛根素浓度回归，葛根素浓度在5～50μg·ml-1范围内线性良好，标准曲线方程C=22.62A-0.471，R=0.9995。

　　2.3 溶液稳定性考察

　　精密称取一定量PU对照品于空白血浆中，配制成浓度为100mg·ml-1溶液，室温放置0，2，4，8，10h后按“2.1.1”项下条件分别进样20μl，结果PU峰面积的RSD为0.92%，表明供试品溶液在10h内较稳定。

　　2.4 重复性实验

　　精密量取100μg·ml-1的PU标准溶液6份，每份0.3ml，加入空白血浆0.2ml，按“2.1.3.2”项样品处理方法进行处理后测定，计算峰面积，RSD值为1.02%，表明该方法重复性良好。

　　2.5 精密度试验

　　精密吸取PU的对照品溶液高、中、低3种浓度各20μl，按“2.1.1”项下条件方法分别重复进样5次，计算峰面积积分值的RSD，高、中、低3种浓度分别为1.35%，0.81%，0.72%，表明方法精密度良好。

　　2.6 回收率测定

　　取100μg·ml-1的PU标准溶液0.3ml，加入到0.2ml小鼠血浆中，按2.1.3.1项方法处理，制备高、中、低3种浓度的样品溶液，进样20μl，测定回收率分别为96.55%，97.85%，95.63%，RSD分别为1.06%，0.95%，1.12%(n=5)。

　　2.7 血药浓度

　　小鼠灌胃给药后葛根素原料药和β环糊精包合物2组各时间点平均血药浓度结果和平均药时曲线见表1、图2

　　图2 包合物与原料药的药时曲线

　　2.8 药动学参数

　　采用DAS2.1.1版药动学分析软件对血药浓度数据进行处理，表明葛根素在体内经时过程符合二室模型(权重为1/C2)，结果见表2。表1 包合物与原料药测定结果表2 葛根素原料药和包合物在体内的药动学参数

　　3 讨论

　　有文献报道可以采用萃取小柱[5]处理血浆，但是操作复杂且成本较高，本文采用4倍甲醇沉淀蛋白[6]后N2吹干方法处理血浆[7]，结果血浆中成分对葛根素的测定不干扰且基线平稳。本实验分别给小鼠按0.2g·kg-1给药，药动学数据经DAS2.1.1版药动学分析软件处理，动力学行为符合二室模型，原料药及其β环糊精包合物中葛根素的AUC和Cmax之间有显著性差异，包合物的AUC为原料药的2.11倍，Cmax为原料药的3倍，表明葛根素经β环糊精包合后可改善葛根素在小鼠体内的吸收，从而有效提高葛根素口服的生物利用度。

参考文献

　　1 肖培根， 李大鹏， 杨世林.新编中药志[M]. 北京化学工业出版社， 2002.144-144.

　　2 Wu YH，Su ZR，LAI XP，et a1.Pharmacokinetics and bioavailability of Yufeng Ningxin Tablet in Beagle dog[J]. Chin Tradit Patent Med (中成药)， 2006， 28(2): 215-218.

　　3 Li Y，Pan WS，Chen SL，et a1.Comparison of pharmacokinetics between puerarin and its phospholipids complex in beagle dogs in vivo[J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药)， 2006， 37(5): 695-697.

　　4 尤思路，高秀蓉，廖昌军，等.饱和水溶液法制备葛根素的β环糊精包合物研究[J]. 西南军医， 2008， 10(4): 17-19.

　　5 金昔陆，朱秀媛，王文杰，等.血浆中葛根素的高效液相色谱测定法及其在狗体内的药代动力学[J]. 药学学报， 1997， 32(10): 782-785.

　　6 胥秀英，郑一敏，傅善权，等.小鼠血浆中葛根素的含量测定及其药代动力学[J]. 重庆中草药研究， 2004， 49(6): 30-32.

　　7 郭炎荣，蒙大平，韦戈，等.高效液相色谱法测定全血中葛根素含量[J]. 中国医院药学杂志， 2000， 20(6): 343-344.