高效液相色谱电喷雾离子阱质谱法推定硫酸依替米星中有关物质的结构

　　　　　　作者：袁耀佐 张玫 钱文 张正行

【摘要】 　　采用高效液相色谱电喷雾离子阱质谱法（HPLCESIITMSn）对硫酸依替米星中有关物质结构进行推定。采用Phenomnex Gemini NX C18色谱柱，以水氨水冰醋酸（96∶3.6∶0.4， V/V）甲醇（70∶30， V/V）为流动相，质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子检测模式；离子源温度350 ℃；雾化氮气压力275.8 kPa；干燥氮气流速10 L/min；离子阱质谱检测器，Smart扫描模式，扫描质量范围m/z 100～900。硫酸依替米星样品中共检出18种有关物质，对其中的13种物质的结构进行了推定，其余5种有关物质的结构未进行解析，只提供了分子量和二级质谱信息。

【关键词】 硫酸依替米星； 高效液相色谱电喷雾离子阱质谱； 结构鉴定

　　Abstract A high performance liquid chromatographyelectrospray ionizationion trapmass spectrometry(HPLCESIITMSn) method for the identification of related substances in etimicin was established. The analytical conditions were as follows: Phenomnex Gemini NX C18(150 mm×4.6 mm， 5 μm) column; the mobile phase:[waterammoniaglacial acetic acid(96∶3.6∶0.4)]methanol(70∶30); flow rate of mobile phase: 1 mL/min; temperature of ESI ion source: 350 ℃; nebulizing pressure: 275.8 kPa; dry gas flow: 10 L/min and the analytes were detected in the positive mode. Eighteen related substances in a etimicin sample were separated and detected by HPLCESIITMSn and thirteen related substances were deduced， they are gentamicin C1a， micronomicin and its three isomers， two etimicin′s isomers， two degradation products of etimicin， two homologues of etimicin， and two other unknown compounds， the other five related substances which MS and MS2 data were detected can not be elucidated.

　　Keywords Etimicin sulfate; High performance liquid chromatographyelectrospray ionization ion trapmass spectrometry; Characterization

　　1 引 言

　　依替米星(Etimicin)，又称1N乙基庆大霉素C1a(图1)，是以庆大霉素C1a 为原料，通过络合催化保护氨基、硅烷化保护羟基、缩合还原型N乙基化等一系列反应，在庆大霉素C1a的1N位上引入乙基而得[1]，具有高效、安全、广谱抗菌、无交叉耐药性等特点[2]，临床应用主要是硫酸盐， 即硫酸依替米星。

　　硫酸依替米星及其相关物质测定多见报道，包括微生物检定法[3]、柱前衍生化高效液相色谱紫外检测法(HPLCUV)[4]、高效液相色谱蒸发光散射检测法(HPLCELSD)[5]、高效液相色谱脉冲电化学检测法(HPLCPED)[6]等，但对硫酸依替米星中有关物质的研究报道极少。刘军等[7]对依替米星合成过程中的N乙基化产物3″氮乙基庆大霉素C1a和1，3″二氮乙基庆大霉素C1a(图1)进行了分离和鉴定，但该方法工作量大、实验周期长。采用高效液相色谱质谱联用技术(HPLCMS)对氨基糖苷类抗生素中有关物质进行结构推定已有很多报道[8～14]，对依替米星及其它氨基糖苷类抗生素质谱裂解规律的研究也有相关文献[15，16]，但采用HPLCMS对硫酸依替米星中有关物质结构推定的报道鲜见。

　　R1R2R3依替米星 EtimicinC2H5HH小诺霉素 MicronomicinHCH3CH3庆大霉素C1a Gentamycin C1aHHH3″氮乙基庆大霉素C1a3″Nethylgentamycin C1aHHC2H51，3″二氮乙基庆大霉素C1a1，3″Ndiethylgentamycin C1aC2H5HC2H5中间体P1 Intermediate P1CH3COCH3COCH3CO文献[9～11]中， 氨基糖苷类抗生素HPLCMS分析的流动相均含三氟乙酸或五氟丙酸，由于它们对电喷雾离子化有强抑制作用，检测灵敏度很低。 Li等[12～14]通过柱后添加丙酸的TFAfix技术[17]提高了离子化效率，但该技术需要在柱后连接泵系统，操作烦琐。本研究基于文献[18]，建立了适合于LCMS分析的流动相。从一批有代表性的硫酸依替米星样品中检出18种有关物质，对其中13种物质的结构进行了推定并参考相关文献和合成工艺佐证推定结果的合理性。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　1100 LC /MSD Trap液质联用仪(美国Agilent 公司)。硫酸依替米星(批号：080103， 080106， 080105，常州方圆制药有限公司)，依替米星、小诺霉素、庆大霉素C1a对照品(中国药品生物制品检定所)，乙腈(色谱纯)，其余试剂均为分析纯。

　　2.2 高效液相色谱及质谱条件

　　Gemini NX C18色谱柱(150 mm ×4.6 mm， 5 μm，美国Phenomnex 公司);以水氨水冰醋酸(96∶3.6∶0.4， V/V)混合液甲醇(70∶30， V/V)为流动相;流速为 1 mL/min;柱温为35 ℃;进样量为20 μL;采用柱后分流模式，分流比为7∶3。电喷雾离子源(ESI)，正离子检测模式;离子源温度350 ℃;雾化氮气压力275.8 kPa;干燥氮气流速10 L/min;离子阱质谱检测器，Smart扫描模式，扫描范围m/z 100～900。

　　3 结果与讨论

　　3.1 部分对照品及硫酸依替米星样品的LCMS分析结果

　　分别准确称取依替米星、小诺霉素、庆大霉素C1a对照品适量，分别用水溶解并稀释制成约0.1 g/L溶液，作为对照品溶液;另准确称取硫酸依替米星适量，用水溶解并稀释， 制成5 g/L依替米星溶液，作为供试品溶液;分别对上述两样品进行一级质谱全扫描(Full scan)和二级质谱离子全扫描 (Full scan MS2)，结果如表1、表2及图2所示。表1 依替米星、小诺霉素和庆大霉素C1a对照品的LCMS测定数据(略)表2 硫酸依替米星样品中有关物质的LCMS数据及推定结构(略)

　　3.2 对照品二级质谱裂解规律分析

　　依替米星、小诺霉素和庆大霉素C1a对照品二级裂解途径分析结果显示如下裂解规律：(1)分子中两糖苷键均可断裂，可单独脱去A环或C环，也可同时脱去A+C环或A+B环，形成相应的加氢离子，二级质谱中脱去A环的加氢离子峰均为基峰，表明连接A、B环的糖苷键更易断裂;(2)分子中的C环容易开环，产生相应的加氢特征离子，A环和B环开环较难;(3)支链裂解不易发生：三组分均除检测到强度极弱的脱氨碎片离子外，其余支链裂解碎片离子均未发现。详细的裂解途径及特征离子如图3所示。

　　3.3 硫酸依替米星样品中有关物质结构推定

　　3.3.1 有杂质对照品的有关物质结构鉴定

　　化合物3和7的色谱保留时间、一级质谱及二级质谱分别与庆大霉素C1a、小诺霉素对照品完全一致(数据见表1和表2)，表明化合物3为庆大霉素C1a，化合物7为小诺霉素。

　　3.3.2 无杂质对照品的有关物质的结构鉴定

　　无杂质对照品的有关物质，通过被称为“诊断碎片离子推断策略”(Diagnostic fragmentionbased extension strategy，DFIBES)[19]进行结构推定。化合物2 (tR=2.5 min)的[M+H]+(m/z 319)，与依替米星脱去C环的降解产物分子量m/z 318吻合，推测化合物2为依替米星脱去C环的降解产物，二级质谱的主要碎片离子m/z 191为依替米星B环的特征离子，旁证推测合理。化合物4 (tR= 3.5 min)的 [M+H]+ m/z 350 与依替米星脱去A环的降解物的分子量m/z 349吻合，二级质谱的主要碎片离子为m/z 191为依替米星B环的特征离子、m/z 160为依替米星C环的特征离子、m/z 233为依替米星的B+C环的开环特征离子，均旁证化合物4为依替米星脱去A环的降解产物。

　　物质5， 6， 7和10的加氢离子[M+H]+均为m/z 464，为物质7(小诺霉素)的同分异构体。

　　物质5 (tR=3.7 min)的二级质谱碎片离子m/z 336， 233， 191， 163和319，其中m/z 191， 233和319与依替米星对应的特征碎片离子相同，提示化合物5的A、B环结构与依替米星的相同;m/z 336比依替米星B+C环特征碎片离子m/z 350少14，推测物质5的C环缺少一个亚甲基，但二级质谱无法确定亚甲基具体丢失的位置，可能的结构如图4a或4b。

　　化合物6(tR=4.4 min)与化合物10(tR=6.4 min)的二级质谱完全相同，均为m/z 447， 336， 291， 205， 174和163，其中m/z 291， 205和163与庆大霉素C1a二级质谱中的对应离子相同，m/z 291为庆大霉素C1a的A+B环的特征离子，提示这两有关物质与庆大霉素C1a有相同的A+B环;化合物6和10的[M+H]+(m/z 464)比庆大霉素C1a的[M+H]+(m/z 450)多14，提示这两有关物质比庆大霉素C1a的C环上多一个亚甲基，m/z 174旁证该推理的合理性，二者可能结构如图5a或5b，但仅根据二级质谱无法准确指认二者具体的化学结构。

　　化合物11和13的 [M+H]+均为m/z 478，为依替米星([M+H]+，m/z 478)的同分异构体。

　　化合物11 (tR = 7.4 min)的二级质谱碎片离子为m/z 322， 461， 160， 163， 205和319;其中m/z 322， 163， 160和205均与庆大霉素C1a中B+C环特征离子相同，提示化合物14中有庆大霉素C1a的B+C环结构，增加的乙基部分应在庆大霉素C1a的A环上。

　　化合物13 (tR = 10.5 min) 与依替米星的一、二级质谱完全相同，提示其为庆大霉素C1a乙酰化的副产物，庆大霉素C1a中有3个可以乙基化基团，即1，3位的氨基和5位羟基，工艺研究结果表明，采用硅烷化保护羟基比较完全，出现羟基乙基化的可能性较小，而1位氨基化产物为依替米星，可以推定化合物11为3N乙基庆大霉素C1a，其二级质谱离子m/z 191也证明了该推测。化合物13即为3氮乙基庆大霉素C1a。

　　化合物14 (tR=12.2 min)对应色谱峰提取的一级质谱为[M+H]+(m/z 478)，但不同时间点提取的二级质谱碎片离子丰度比差别较大，提示该色谱峰多组分混合峰，需要进一步改善分离条件后再进行结构分析。

　　化合物15和16为tR=19.0 min色谱峰中的2个成分，即该色谱峰为混合峰。化合物15的[M+H]+为m/z 378，比化合物4(m/z 350，依替米星脱去A环的降解产物)多28 Da，提示结构中多1个乙基，二级质谱为m/z 219， 261和160，其中m/z219比有关化合物4的B环特征离子m/z 191多28 Da，推测乙基增加在B环上，m/z 160提示有依替米星的C环结构，化合物15结构如图略。

　　化合物16的[M+H]+为m/z 479，比依替米星的[M+H]+ m/z 478多1 Da，其二级质谱碎片离子m/z 350和233为依替米星典型的B+C环特征离子，m/z 191和160旁证结构中依替米星B环和C环存在，由此推断增加的1 Da应在A环上，根据氮规则得知，其A环上的氨基可能为羟基取代，m/z 320和462旁证推测的合理性，但具体取代位置无法通过二级质谱判断。化合物16可能的结构应如图6a或6b所示。

　　化合物17 (tR=24.7min)与化合物18 (tR=28.8 min)为同分异构体，[M+H]+均为m/z 492，比依替米星的[M+H]+(m/z 478)多14 Da，提示结构中增加了一个亚甲基。

　　化合物17的二级质谱碎片离子为m/z 475， 350， 333， 233， 191和160，其中m/z 350和233为依替米星的B+C环特征离子，m/z 191和60分别为依替米星的B环和C环特征离子，推测化合物17结构中有依替米星的B+C环结构，m/z 333比依替米星中A+B环特征离子m/z 319多14 Da，推测化合物17的A环中比依替米星A环多一个甲基。

　　化合物18的二级质谱碎片离子为m/z 475， 429， 364， 319， 191和174，由m/z 191为依替米星的A环特征离子，m/z 319为依替米星的A+B环特征离子，推测化合物18的结构中有依替米星的A+B环结构，增加的亚甲基应在C环上，m/z 364和174旁证该推测的合理性。化合物18可能的结构如图7所示。上述推测结果与化合物5和6或化合物10的结构呼应，提示化合物17和18可能是它们中某个成分的乙酰化产物。

　　3.4 小结

　　本研究建立用于硫酸依替米星中有关物质结构推定的HPLCESIITMSn方法。本实验中流动相的pH值高达10.0。通常，电喷雾离子化方式应有利于负离子检测，但实验表明，正离子模式的检测灵敏度远高于负离子模式，可能的原因是流动相中氨水比冰醋酸易挥发，在电喷雾去溶剂化过程中，残存液滴由碱性变为酸性，使待检组分容易形成加氢离子。

参考文献

　　1 XUE ChunXia(薛春霞)， ZHAO WenJie(赵文杰)， LU YuFeng(陆玉峰). Qilu pharmaceutical Affairs(齐鲁药事)，2005， 24(2): 106～108

　　2 ZHAO Min(赵 敏)， FAN Jin(范 瑾). Bull. Med. Res.(医学研究通讯)， 2002， 31(7): 24～25

　　3 ZHAO Min(赵 敏)， YANG XiaoWei(杨晓伟)， HU XiaoLing(胡小玲)， WANG Jie(汪 洁). Chin. J. Antibiotics(中国抗生素杂志)， 1995， 21: 13～17

　　4 ZHANG Mei(张 玫)， YUAN YaoZuo(袁耀佐)， FAN QingFeng(范青峰)， GAO XiangDong(高向东). Progress in Pharmaceutical Sciences(药学进展)， 2004， 28(7): 314～317

　　5 Editorial Committee of the Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China(中华人民共和国药典委员会). Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China (2nd Part)(中华人民共和国药典， 二部). Beijing (北京) : Chemical Industry Press (化学工业出版社) ， 2005: 740

　　6 Xi L L， Wu G F， Zhu Y. J. Chromatogr. A， 2006， 1115(12): 202～207

　　7 LIU Jun(刘 军)， HU XiaoLing(胡小玲)， SHEN YiQun(沈依群)， FAN Jin(范 瑾) ， ZHAO Ming(赵 敏). Chin. J. Pharm.(中国药学杂志)， 2000， 31(8): 358～360

　　8 Hu P F， Chess E K， Brynjelsen S， Jakubowski G. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， 2000， 11(3): 200～209

　　9 WANG Jian(王 建)， LI ZhongHong(李忠红)， NI KunYi(倪坤仪)， WANG ZhiQun(王志群). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2006， 34(7): 979～982

　　10 WANG Jian(王 建)， HU XiaoJun(胡小君)， NI KunYi(倪坤仪). Chin. Pharm. J.(中国药学杂志)， 2006， 41(16): 1268～1271

　　11 WANG Jian(王 建)， HONG LiYa(洪利娅)， NI KunYi(倪坤仪) . Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2006， 34: S19～S22

　　12 Li B， Adams E， Van Schepdael A， Hoogmartens. J. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2006， 20(3): 393～402

　　13 Li B， van Schepdael A， Hoogmartens J， Adams E. J. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2007， 21(11): 1791～1798

　　14 Li B， van Schepdael A， Hoogmartens J， Adams E. J. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2008， 22(22): 3455～3471

　　15 ZHOU MaoJin(周茂金)， ZHONG DaFang(钟大放)， SUN YuMing(孙玉明)， LIU ChangXiao(刘昌孝). Acta Pharm. Sin.(药学学报)， 2004， 39(10): 826～830

　　16 YANG LiHong(杨利红)， HU ChangQin(胡昌勤)， LIU WenYing(刘文英). Chin. J. Pharm. Anal.(药物分析杂志)， 2006， 26(8):1050～1057

　　17 Thomas M. Annesley. Clinical Chemistry， 2003， 49(7): 1061～1064

　　18 Vogel R， Defillipo K， Reif V. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2001， 24(3): 405～412

　　19 Zheng C N， Hao H P， Wang X， Wu X L， Wang G J， Sang G W， Liang Y， Xie L， Xia C H， Yao X L. J. Mass. Spectrom.， 2009， 44(2): 230～244