高效液相色谱法测定猪尿中克伦特罗对映异构体残留量

　　　　 作者：吴银良 杨挺 单吉浩 皇甫伟国

【摘要】 　　建立了测定猪尿中克伦特罗对映异构体残留量的高效液相色谱分析方法。在碱化的条件下，用乙酸乙酯提取10 mL猪尿样品，提取液经稀HCl反萃取，萃取液直接过SCX固相萃取小柱，再用5%氨化甲醇洗脱，洗脱液经氮气吹干后用200 μL甲醇定容。采用Astec CHIROBIOTICTM V手性色谱柱，以V（甲醇）∶V（冰乙酸）∶V（三乙胺）=99.94∶0.02∶0.04为流动相进行HPLC分析，检测波长301 nm，外标法定量。克伦特罗单对映体的峰面积与其浓度在70～5000 μg/L范围内呈良好的线性； 线性相关系数均大于0.9996； 猪尿样品中检出限为0.30 μg/L。猪尿中克伦特罗对映体在1.0～20.0 μg/L范围内的添加回收率为76.3%～91.5%； 相对标准偏差RSD均小于7%(n=5)。

【关键词】 克伦特罗； 对映异构体； 高效液相色谱法； 猪尿

　　Abstract A method was developed for the determination of residual clenbuterol enantiomers in swine urine by high performance liquid chromatography. A 10mL sample was extracted with ethyl acetate under basic condition. Then， clenbuterol enantiomers were stripped from the extract using diluted hydrochloric acid to remove the fat. The hydrochloric acid extract was purified by SCX solid phase extraction(SPE) cartridge. The eluent was dried by nitrogen and then dissolved in 200 μL methanol. The samples were analyzed on a chiral column(Astec CHIOBIOTICTM V) with a mixture of methanolacetic acidtriethylamine as the mobile phase and quantified with the external standard calibration curve method. The detection wavelength was set at 301 nm. Good linearities were obtained for the two enantiomers at the concentration of 70-5000 μg/L with the linear relative coefficient more than 0.9996. The recoveries for the two enantiomers in urine were 76.3%-91.5% at the fortified levels of 1.0-20.0 μg/L with the limit of detection of 0.30 μg/L. The relative standard deviations were less than 7.0%.

　　Keywords Clenbuterol; Enantiomers; High performance liquid chromatography; Swine urine

　　1 引 言

　　克伦特罗(Clenbuterol)俗称“瘦肉精”，是人工合成的β肾上腺素能受体激动剂之一。生产中以外消旋体形式为主，当它高剂量添加在饲料中，可导致动物体内的脂肪分解代谢增强，蛋白质合成增加，显著提高酮体的瘦肉率[1]。由于克伦特罗易在动物组织中形成残留，曾多次发生中毒事件。目前，我国已禁止其作为生长促进剂使用。王培龙等[2]采用分子印迹固相萃取气相色谱质谱法(GCMS)方法检测动物尿液中克伦物罗的残留。然而在评估克伦特罗危害时，通常不区分克伦特罗手性对映体，而手性对映体在药理、毒性、代谢及排泄方面存在差异。因此，有必要开展克伦特罗在生物样品中对映体分析方法研究和相关动物体内选择性残留行为研究。

　　目前，对克伦特罗外消旋体的拆分报道较多[3～7]，主要有高效液相色谱法[3～6]和毛细管电泳法[7]。AboulEnein等报道了人体血浆中克伦特罗对映体的痕量分析方法[8]，但该方法检出限仅能达到69 μg/L，无法满足通常动物组织和尿液中检测出低于1.0 μg/kg(L)的分析要求。对于动物组织和尿液中克伦特罗外消旋体残留的分析方法虽然较多，其中涉及的分析手段有酶联免疫吸附法(ELISA)[9，10]、GCMS[11，12] 、高效液相色谱法(HPLC)[13]及高效液相色谱串联质谱法[14]等，但对动物组织和尿液中克伦特罗对映体的分析方法和残留消除研究非常少，仅见Smith等[15]运用手性气相色谱柱建立了动物组织中对映体分析方法，但分析时间较长，约55 min。

　　本实验采用高效液相色谱法实现了克伦特罗对映体的拆分，并在前期对克伦特罗残留量分析前处理方法研究的基础上[11，18]，建立了提取与净化效果较好，分离速度快的猪尿中克伦特罗手性对映体残留量分析方法。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　2695液相色谱仪、996二极管阵列检测器(美国Waters公司);色谱柱：Astec CHIROBIOTICTM V手性柱(25 cm × 4.6 mm，5 μm);离心机(Sigma 公司);SCX 小柱： LCSCX，Supelco Park(500 mg，3 mL)。盐酸克伦特罗标准品(Dr. Ehrenstorfer公司);甲醇(色谱纯，Fisher公司);乙酸和三乙胺(分析纯，上海化学试剂公司)。

　　2.2 色谱分离条件

　　对映异构体制备色谱分离条件：流动相为V(甲醇)∶V(乙酸)∶V(三乙胺)=99.98∶0.01∶0.01，进样量50 μL，柱温30 ℃。

　　对映异构体残留量色谱分离条件：流动相为V(甲醇)∶V(乙酸)∶V(三乙胺)=99.94∶0.02∶0.04，进样量60 μL，柱温30 ℃，检测波长301 nm。

　　2.3 样品处理

　　2.3.1 提取

　　准确吸取10 mL猪尿于50 mL塑料离心管中，加入3 mL 10% Na2CO3溶液; 再加入20 mL乙酸乙酯， 旋涡混合30 s，以5000 r/min离心2 min，吸取上层溶液，再以15 mL乙酸乙酯同样步骤提取一次，合并提取液;在收集的提取液中加入5 mL 0.20 mol/L HCl溶液，旋涡混合30 s，以5000 r/min离心2 min，吸取下层溶液。同样步骤重复萃取一次，合并两次萃取液。

　　2.3.2 固相萃取净化

　　SCX小柱依次用5 mL 甲醇、5 mL水和5 mL 30 mmol/L HCl活化，然后将2.3.1中的萃取液上样至小柱中，依次用5 mL水和5 mL甲醇淋洗柱子。在溶剂流过固相萃取柱后，抽干SCX小柱，再用5 mL 4%氨化甲醇溶液洗脱，在50 ℃水浴中用氮气吹干上述洗脱液，待试管冷却后加入200 μL甲醇，再装入有内衬管的进样小瓶中，进行HPLC分析。

　　2.4 添加回收率实验

　　实验样品处理过程同2.3，猪尿中克伦特罗对映体添加浓度为1.0， 5.0和20.0 μg/L。 分 析 化 学第38卷第6期吴银良等：高效液相色谱法测定猪尿中克伦特罗对映异构体残留量

　　3 结果与讨论

　　3.1 克伦特罗对映体分离及出峰顺序

　　有关克伦特罗对映体分离的研究多采用大环抗生素型手性色谱柱。本研究采用Astec CHIROBIOTICTM V手性色谱柱。在甲醇/冰乙酸/三乙胺体系内对克伦特罗对映体进行了拆分，结果见表1和图1。当柱温为30 ℃，乙酸浓度相同时，随着三乙胺浓度的增加，分离度降低，分析时间缩短，灵敏度增高;同样，当三乙胺浓度相同时，随着乙酸浓度的增加，分离度降低，分析时间缩短，灵敏度增高。从已有的研究可知，包括克伦特罗在内的β2受体激动剂与大环内酯类药物手性固定相最重要的相互作用主要为氢键作用、ππ电子相互转移、偶极诱导作用[6]。本实验主要是通过乙酸和三乙胺浓度的变化影响氢键作用， 导致两对映体的洗脱速度发生变化， 最终造成出峰时间和分离度变化。

　　为了在保证克伦特罗对映体分离的情况下尽可能获得最大的灵敏度，本方法进行残留分析时选择V(甲醇)∶V(乙酸)∶V(三乙胺)=99.94∶0.02∶0.04作为流动相。表1 克伦特罗对映体在甲醇/冰乙酸/三乙胺体系内的分离度(略)

　　本研究根据Sigma[17]提供的G004621操作规程确定克伦特罗对映体的出峰顺序。本实验所用的流动相体系(V(甲醇)∶V(乙酸)∶V(三乙胺)=99.98∶0.01∶0.01和柱子均与G004621操作规程一致，所以可以确认先出峰的为(-)对映体，后出峰的为(+)对映体。

　　3.2 提取净化方法的选择

　　本方法的提取净化过程主要根据农业行业标准NY/T 4682006的前处理方法进行[16]，但对其略有修改。原因是样品量从原有的5 g增加为10 mL时，实验回收率相对较低，(-)对映体在添加浓度20.0 μg/L时回收率为62.3%～75.7%。本研究适当增加了提取剂用量，从原有的25 mL(第一次15 mL， 第二次10 mL)增加到35 mL(第一次20 mL，第二次15 mL);再将反萃取时HCl的浓度从0.1 mol/L增加0.2 mol/L，并且萃取液未调pH值直接过SCX小柱，在同样添加浓度下，(-)对映体的回收率为82.7%～91.2%(表2)。

　　3.3 检测波长的选择

　　采用HPLC测定克伦特罗时，波长通常选择246 nm，原因是该波长下灵敏度相对较高; 但是在该波长下也容易受到杂质的干扰。按照上述方法和GB/T 5009.1922003标准[12]处理后的样品在该色谱体系下246 nm分析时，均有较多的杂质峰出现。本研究根据克伦特罗光谱图(图2)选择301 nm进行分析，空白样品、添加样品和残留消除样品图谱见图3。由图3可见，克伦特罗对映体出峰处无杂质明显干扰。

　　3.4 前处理过程对克伦特罗对映体的影响

　　研究表明，已烯雌酚两对映体残留分析时，顺反式会相互转化[18]。本研究为了考察克伦特罗对映体在前处理过程是否发生转化，根据2.2对映异构体制备色谱分离条件分别收集了两种对映体，并分别进行添加实验(200 μg/L)。结果表明，顺反式各自添加时，色谱图均未出现另一种对映体，表明克伦特罗对映体在整个前处理过程中未发生相互转化。

　　3.5 方法的线性方程、检出限、回收率和精密度

　　在70～5000 μg/L浓度范围内，以克伦特罗两对映体峰面积对浓度作图，所得曲线方程为y=63.201x+189.92((-)对映体)，y=62.589x-29.921((+)对映体)，相关系数(r)均大于0.9996。采用在空白样品中添加标准溶液的方法，对猪尿样品中克伦特罗两对映体进行了3个水平添加回收实验，每个浓度点重复5次，实验结果见表2。从表2可见，猪尿中克伦特罗对映体各浓度点添加回收率在76.3%～91.5%之间; 批内RSD在3.1%～6.2%之间，批间RSD在4.6%～6.9%之间。由此可见，本方法具有较好的准确性和重现性。按信噪比S/N=3计算方法，猪尿样品中克伦特罗两对映体的检出限均为0.30 μg/L。表2 猪尿中克伦特罗对映体的检出限、回收率和精密度(略)表3 休药期间猪尿中克伦特罗两对映体的浓度(略)

　　3.6 实际样品测定

　　利用本方法对猪尿和猪血液中残留消除相关性进行了研究，其中休药期间猪尿中克伦特罗两对映体浓度变化见表3。本实验饲料中盐酸克伦特罗浓度为4mg/kg，连续喂药时间为15 d，每个休药时间点的样品数为5个。从表3可知，休药前期(-)对映体浓度较高，后期(+)对映体浓度较高。图3c为休药8 d的猪尿样品分析图谱，该样品中(-)对映体含量为(4.26±0.25)μg/kg(n=3)，(+)对映体含量为(8.63±0.42)μg/kg(n=3)。

参考文献

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