应用体外仿生模型分析海藻水煎液中微量金属的形态和生物可给性

　　　　　　 作者：林路秀 李顺兴 郑凤英‘

【摘要】 　　将体外“半仿生消化”和“全仿生消化”法分别应用于海藻分析前处理，即模拟人体消化环境，加入消化液所含有机物和无机物，模拟海藻(海带和紫菜)水煎液在胃肠中的吸收和转运机制。鉴于消化管和血管间的生物膜是类脂质膜，以单层脂质体为细胞生物膜模型考察海藻水煎液中微量金属在单层脂质体水体系中的分配行为。以单层脂质体结合态、水溶态界定水煎液中微量金属的形态; 以单层脂质体结合态含量评价微量金属的生物可给性; 比较单层脂质体结合态金属在胃肠中浓度，确定微量金属的主要吸收部位。消化酶对海藻中微量元素的形态和生物可给性影响明显。水煎液全仿生消化后，海带和紫菜中的Fe均主要在胃被吸收，海带中的Mn和Zn主要在肠被吸收;紫菜中的Mn和Zn在胃与肠均有吸收。

【关键词】 体外仿生消化; 细胞膜仿生萃取; 海藻; 微量金属; 形态分析; 生物可给性评价

　　Abstract Two new bionic technologies， i.e. in vitro bionic digestion and bionic biomembrane extraction， were developed for the pretreatment of marine algal soup. The soup of Laminaria japonica and Porphyra haitanensis was digested at 37 ℃ under the action of saliva， the acidity of the stomach or intestine with the inorganic and organic compounds(including digestive enzymes) that were found in the stomach or intestine， and then the chymes were obtained. Being similar to the biomembrane between the gastrointestinal tract and blood vessels， monolayer liposome was used as biomembrane model. Monolayer liposomebonded(MLBMs) was used for oral bioaccessibility assessment of trace metals(Fe， Mn and Zn) in the chyme. The species distribution and bioavailability of trace metals in marine alga were obviously affected by the existence of the bioenzymes. Based on the concentration of MLBMs and wholebionic digestion， the main absorption site of trace metals in marine algal soup was proposed as follow: iron in both Laminaria japonica and Porphyra haitanensis was absorbed mainly in stomach; manganese and zinc in Laminaria japonica were absorbed mainly in intestine and these two metals in Porphyra haitanensis were absorbed both in stomach and intestine.

　　Keywords In vitro bionic digestion; Biomimetic membrane extraction; Marine alga; Trace metals; Speciation analysis; Bioavailability assessment

　　本文系国家自然科学基金(No. 20775067)、福建省高校服务海西建设重点项目(No.闽教高200908)、福建省科技厅项目(No.2008F5063)、福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划(No.闽科教200720)资助项目

　　1 引 言

　　海带和紫菜为海生植物，营养丰富，是理想的食疗佳品。现代药理研究表明：海带和紫菜中的多糖具有调节血脂、降血压、抗肿瘤、抗突变、防辐射及抗氧化等功效[1～3]。近年来，海藻微量金属分析多限于总量测定[4～8]。微量金属的生物可给性和毒性与其形态密切相关[9]。药用植物的基体成分复杂，分析元素的具体形态(结合态、价态和结构态)费用高、耗时，且目前样品前处理技术无法胜任，因此美国食品药物管理署(U.S. Food and Drug Administration)对此未做要求。

　　本研究采用体外仿生消化技术对海藻(海带、紫菜)水煎液进行预处理，应用“半仿生消化”(不含消化酶) 和“全仿生消化”(含消化酶)方法，探讨胃和肠所含的有机物、无机物及消化酶对海藻水煎液中微量金属(Fe， Mn， Zn)形态和生物可给性的影响。鉴于消化管和血管间的生物膜是类脂质膜，以单层脂质体为细胞生物膜模型，以单层脂质体结合态和水溶态定义植物类食品和药物中微量金属的形态和生物可给性，以单层脂质体水分配体系模拟海藻水煎液仿生提取液在人体中分配、吸收的情况。与动物模型相比，体外全仿生消化和单层脂质体萃取联用技术评价药物或者食物中微量金属的形态和生物可给性，更可靠、简便、易行。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　GBC932AA型原子吸收光谱仪，铁、锰、锌元素空心阴极灯(澳大利亚GBC公司);MK型光纤压力自控密闭微波消解系统(上海新科微波溶样测试技术研究所);RE52型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂); 86CULT超低温冰箱(Thermo Electron 公司); SHAB水浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司); 320S型pH计(梅特勒托利多仪器公司); Leica DM LB2徕卡显微镜(德国徕卡仪器有限公司)。

　　浓HNO3和浓HCl(优级纯)，KCl(分析纯); 淀粉酶、尿酸、粘液素、牛血清蛋白、胃蛋白酶、胰液素、脂肪酶、胆汁和卵磷脂(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)。 Fe， Mn， Zn的标准贮备液(1.0 g/L，澳大利亚GBC公司); 超纯水。

　　海带和紫菜购买于漳州市，经漳州市食品药品检验所陈育琳教授鉴定。用自来水将海带和紫菜样品洗净，用超纯水冲洗3遍，于80 ℃下恒温烘干至恒重，备用。

　　2.2 Fe， Mn和Zn标准曲线测定

　　准确量取1 g/L Fe， Mn， Zn标准储备液适量，用5% HCl(V/V)配制浓度分别为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mg/L Fe标准溶液和0.3，0.5，0.8，1.2和1.4 mg/L Zn标准溶液;用5% HNO3(V/V)配制浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5和3.5 mg/L Mn标准溶液;火焰原子吸收光谱法(FAAS法)测定Fe， Mn和Zn的吸光度，分别绘制标准曲线。FAAS工作参数见表1。表1 火焰原子吸收光谱工作条件(略)

　　2.3 胃和肠半仿生及全仿生消化液制备[10]

　　

参考文献

[10]，(1) 制备胃和肠半仿生消化液 分别加入胃和肠中所含的有机物和无机物，调pH值至各消化液对应的pH值;(2) 制备胃和肠全仿生消化液 在半仿生消化液的基础上，分别加入相应消化酶。具体配制方法如表2。表2 唾液、胃液、十二指肠液、胆汁组成成分(略)

　　2.4 海藻水煎液制备及其半仿生和全仿生提取液制备

　　称取海带、紫菜样品各约20 g，每次加超纯水200 mL，加热至沸腾，保持微沸约1 h，煎煮3次; 合并3次煎煮液，用0.45 μm滤膜过滤，加热浓缩并定容至500 mL，得水煎液，于4 ℃下保存待用。

　　各取海带、紫菜水煎液80 mL，加半仿生或全仿生唾液5 mL，在37℃下恒温振荡5 min后，加胃液150 mL，在37℃下恒温振荡2 h，从胃仿生消化食靡中取100 mL，用0.45 μm滤膜抽滤，得胃半仿生或全仿生提取液;往余下的胃仿生消化食靡中加十二指肠液200 mL和胆汁80 mL，在37 ℃下恒温振荡7 h，取肠仿生消化食靡100 mL，用0.45 μm滤膜抽滤，得水煎液肠的半仿生或全仿生提取液。胃和肠的半仿生或全仿生提取液于4 ℃下保存待用。

　　2.5 海藻水煎液及其仿生提取液在单层脂质体水体系中分配行为研究

　　

参考文献

[12]制备单层脂质体：称取约0.25 mg蛋黄卵磷脂，溶于5 mL氯仿，将溶液移入具塞圆底烧瓶，于旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发10 min，形成均匀的多层脂质体膜;分别取海藻水煎液、水煎液的仿生提取液各25 mL，加至多层脂质体中，充氮气，水浴恒温(37 ℃)振荡，让脂质体膜全部进入仿生提取液中，在超低温冰箱(-71 ℃)中冷冻20 min，于37 ℃下融化，重复冻融3次，促进仿生提取液在单层脂质体水体系中的分配。制成的单层脂质体，用俫卡显微镜(放大倍数4000倍)表征如图1所示。

　　单层脂质体粒径为0.3～0.35 μm，依次用孔径为0.45和0.22 μm的滤膜抽滤冻融液，可使单层脂质体膜从溶液中分离，海带、紫菜水煎液的仿生提取液中单层脂质体结合态和水溶态微量金属分别存留于单层脂质体膜相和水相(即滤液)中。

　　2.6 海藻水煎液及其仿生提取液中微量金属测定

　　取10 mL海藻水煎液、 2.3节制得的海藻水煎液胃(或肠)仿生提取液10 mL、2.4节制得的单层脂质体膜相(全部)和水相(10 mL)于消化罐中，加浓4.0 mL HNO3和2.0 mL h3O2，消解10 min，冷却，定容至25 mL，分别用于海藻水煎液中微量金属总含量、仿生提取液金属含量、仿生提取液中单层脂质体结合态、水溶态金属含量的测定。

　　3 结果与讨论

　　3.1 回收率实验

　　以海带和紫菜的水煎液为样品，用标准加入法进行回收率实验，由表3可见，被测微量金属的回收率为96.7%～103.1%，说明微波消解FAAS法测定海带和紫菜的水煎液中微量金属含量准确度较好，结果可靠。表3 海藻水煎液中微量金属Fe， Mn和Zn含量及其回收率(略)

　　3.2 海藻水煎液仿生胃肠提取液中微量金属形态分析和生物可给性评价

　　海藻半仿生和全仿生提取液中微量金属单层脂质体结合态和水溶态含量如表4所示。海带水煎液的半仿生胃提取液中，Fe， Mn， Zn均以水溶态为主;海带水煎液肠提取液中，Fe以单层脂质体结合态为主，Mn和Zn单层脂质体结合态与水溶态含量相差不大。紫菜水煎液的半仿生胃提取液中，Fe， Zn的单层脂质体结合态和水溶态含量相当，Mn以水溶态为主;紫菜水煎液的肠提取液中，Fe和Zn以单层脂质体结合态为主，Mn以水溶态为主。海带水煎液全仿生消化后，胃提取液中Fe， Mn和Zn均以水溶态为主;肠提取液中Fe以水溶态为主，Mn和Zn以单层脂质体结合态为主。紫菜水煎液全仿生消化后，胃提取液中Fe和Mn以水溶态为主，Zn以单层脂质体结合态为主;肠提取液中Fe， Mn， Zn均以水溶态为主。对比胃提取液和肠提取液中单层脂质体结合态微量金属含量可得，海带和紫菜中Fe均主要在胃被吸收，海带中Mn和Zn主要在肠被吸收;紫菜中Mn和Zn在胃、肠均有吸收。由半仿生和全仿生后单层脂质体结合态微量金属含量可得，消化酶通过影响消化过程，影响微量金属配合物的配体组成，从而对海藻中微量元素的形态和生物可给性产生明显影响。表4 海藻水煎液半仿生和全仿生提取液中微量金属Fe， Mn和Zn形态分析(略)

　　3.3 仿生消化对海藻水煎液中微量金属配合物分配系数的影响

　　以正辛醇为生物膜模型评价中药中微量金属的形态和生物可给性已有报道[12～15]。全仿生消化后，胃肠仿生提取液接近其在消化系统消化后的有效成分群，微量金属也转化成细胞膜吸收前最终配合物[16]。鉴于消化管和血管间的生物膜是类脂质膜，以单层脂质体为细胞生物膜模型和固相萃取剂，提取具有细胞膜亲合性的中药有效成分群，合乎中医药理论的系统观和整体观。以单层脂质体结合态金属含量评价金属细胞膜亲合性、生物可给性，较常用的有机态，更能揭示其药理和药效机制。本实验以单层脂质体/水体系测定药物的分配系数DMW (DMW =化合物在单层脂质体膜相中平衡浓度/该化合物水相中的平衡浓度)。海带和紫菜水煎液的仿生提取液中微量金属的DMW如表5所示。表5 海带和紫菜的水煎液胃、肠半仿生和全仿生提取液中Fe， Mn和Zn分配系数DMW值(略)

　　对于海带水煎液，半仿生消化后，Fe， Mn， Zn在肠提取液中的DMW值高于胃提取液;全仿生消化后，Fe在胃提取液中的DMW值高于肠提取液，Mn和Zn在肠提取液中的DMW值高于胃提取液;加入消化酶，胃提取液中Mn，Zn的DMW值降低，Fe的DMW升高，而肠提取液情况却相反。

　　对于紫菜水煎液，加入消化酶，胃肠提取液中Fe和Mn 的DMW值下降;Zn的DMW值在胃提取液中显著增加，但在肠提取液中下降。微量金属的DMW值越高，单层脂质体结合态金属所占比例越高，生物可给性越强。上述情况说明消化酶可通过影响微量金属配合物的配体组成，从而对海带和紫菜中的微量元素的形态分布和生物可给性产生影响。

　　海藻种类和仿生消化方式差异对微量金属配合物的形态分布影响随金属种类不同而异，主要归因于：(1)海藻种类不同，其有机和无机成分不同，经不同的消化方式后产生的食糜中成分也不同，导致微量金属配体的差异性;(2)不同微量金属的配位能力不同;(3)金属间和配体间均产生配位竞争反应。海藻中基体成分复杂，因此评价海藻中微量金属的形态和生物可给性，可通过全仿生消化进行预处理，再采用仿生细胞膜萃取，以细胞膜亲合性为评价依据，鉴别微量金属的形态和生物可给性。

参考文献

　　1 Yuan Y V， Walsh N A. Food Chem. Toxico.， 2006， 44: 1144～1150

　　2 Wang J， Zhang Q， Zhang Z S， Li Z E. Int. J. Biol. Macromol.， 2008， 42(2): 127～132

　　3 Zhang Z S， Zhang Q B， Wang J， Shi X L， Song H F， Zhang J J. Carbohydr. Polym.， 2009， 78(3): 449～453

　　4 Jackson G E， MkhontaGama L， Voyé A， Kelly M. J. Inorg. Biochem.， 2000， 79(14): 147～152

　　5 Wondimu T， Ueno A， Kanamaru I， Yamaguchi Y K， McCrindle R， Hanaoka K I. Food Chem.， 2007， 104: 542～555

　　6 Ródenas de la Rocha S， SánchezMuniz F J， GómezJuaristi M， Larrea Marín M T. J. Food Comp. Anal.， 2009， 22: 330～336

　　7 Subba Rao P V， Mantri V A， Ganesan K. Food Chem.， 2007， 102: 215～218

　　8 DomínguezGonzález R， MoredaPińeiro A， BermejoBarrera A， BermejoBarrera P. Talanta， 2005， 66(4): 937～942

　　9 GUO PengRan(郭鹏然)， MOU DeHai(牟德海)， WANG Chang(王 畅)， QIU RongLiang(仇荣亮)， DU Hong(杜 虹). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2009， 37(11): 1645～1650

　　10 Oomen A G， Rompelberg C J M， Bruil M A， Dobbe C J G， Pereboom D P K H， Sips A J A M. Arch. Environ. Contam. Toxicol.， 2003， 44: 281～287

　　11 DAI ShuGui (戴树桂)， WANG YuQiu (王玉秋)， SUN HongWen (孙红文)， LI ShuXia (李书霞)， CAO ZhongHong (曹仲宏). Chin. J. Environ. Sci.(环境科?)， 2002， 23(4): 97～101

　　12 Li S X， Deng N S， Zheng F Y. J. Pharmaceut. Biomed. Anal.， 2003， 32: 51～57

　　13 Li S X， Deng N S， Zheng F Y. Bioorg. Med. Chem. Lett.， 2004， 14(2): 505～510

　　14 Li S X， Zheng F Y， Liu X L， Cai W L. Phytochem. Anal.， 2005， 16(6): 405～410

　　15 Zheng F Y， Li S X， Lin L X. J. Trace Elem. Med. Bio.， 2007， 21: 77～83

　　16 Li S X， Zheng F Y. Planta Med.， 2008， 74(10): 1302～1307

转贴用夥崖畚南略刂行男?http://www.studa.ne>