作者：王海侠 ，吴云，时维静 ，郜尽
【摘要】 目的 优化白茅根多糖的提取工艺并对其含量进行测定。方法 以白茅根多糖得膏率为考察指标，采用正交试验法对提取过程中的温度、次数、时间及料液比四因素进行优选研究，采用苯酚-浓硫酸法测定多糖含量。结果 提取次数对多糖提取的影响最显著，其次是提取温度，提取时间和用水量对其影响较小。结论 白茅根多糖的最佳提取工艺条件是用15倍水量在85 ℃温度下回流提取3次，每次水提取时间为3 h。两产地的多糖含量均在0.15%以上。
【关键词】 白茅根;多糖;正交试验;苯酚-硫酸法;含量测定
Abstract：Objective To optimize the extracting conditions of polysaccharide from Imperata Cylindrica and establish a suitable method for its content determination. Methods Based on the qualitative yield of polysaccharide extraction， a orthogonal test was employed to evaluate the effect of four factors including extracting temperature， extracting time， the extraction times and the ratio of material to liquid. The phenol-dense sulphuric acid method was applied for the content determination of polysaccharide. Results The times of extraction and the extracting temperature influenced the content of polysaccharides mostly， while the duration of extraction and the amount of water showed little influence. Conclusions The optimum extraction condition was refluxing and extracting for 3 times at 85 ℃ for 3 hours， and with 15 folds of water for every time. The contents of polysaccharide in Imperata Cylindrica collected from two different places were above 0.15%.
Key words：Imperata Cylindrica;polysaccharide;orthogonal design;phenol-dense sulphuric acid method;content determination
白茅根[Imperata Cylindrica (L.) Beauv. var. major (Nees) C. E. Hubb.]为禾本科植物白茅的根茎，具有凉血止血、清热利尿的功效，临床主要用于治疗急性肾炎、急性传染性肝炎等[1]。白茅根的成分以三萜类化合物为主，含有葡萄糖、少量果糖和木糖等。白茅根具有极大的药用与食用价值，而多糖为其最主要的成分之一。已有实验表明，白茅根多糖具有明显提高小鼠耐缺氧能力[2]。白茅根味道甘甜，口感醇厚，国内很多地方都有咀嚼、食用的习惯，是难得的食品添加剂，工业上可作为优良的清热、消暑饮料的原料[3-4]。实验表明，白茅根毒性小，食用比较安全，小鼠LD50高达20 g/kg以上[5]。然而，目前白茅根潜在的市场价值还远没有开发出来。我们以白茅根多糖含量为考察指标，用苯酚-硫酸法进行含量测定，考察料液比、提取温度、提取时间、提取次数等因素，确定提取多糖的最佳工艺条件。同时，比较河北安国和安徽亳州两产地的白茅根中的多糖含量，为进一步的市场开发利用提供理论基础。
1 仪器与试药
台式高速离心机(LG10-24A北京医用离心机)、电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9070上海三发科学仪器)、HJ-3控温磁力搅拌器(江苏金城国胜实验仪器)、电子天平(AK1140奥豪斯仪器)、TU-1901双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器)、HH-2数显恒温水浴锅(国华电气)、FD-1D-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器)。
白茅根产地为亳州和安国，购于亳州中药材市场，由安徽科技学院时维静教授鉴定。葡萄糖对照品(分析纯，国药集团，批号F20071214)。
2 方法
2.1 对照品溶液的制备
精确称取干燥至恒重的葡萄糖0.250 g，用重蒸水定容至250 mL，配成质量浓度为1.0 mg/mL的储备液。
2.2 苯酚精制及配制
称取苯酚100 g，加铝片0.1 g与碳酸氢钠0.05 g，蒸馏收集182 ℃馏分，吸取此馏分5 mL，加水至100 mL，置棕色瓶中，即得。
2.3 白茅根多糖的提取
2.3.1 前处理 称取350 g白茅根粉末，加适量石油醚(60～90 ℃)回流2次，每次1 h，倒出石油醚，烘箱中60 ℃烘干，用80%乙醇回流提取2次，每次1.5 h。处理后的药材粉末在烘箱中60 ℃烘干。
2.3.2 水提取粗多糖 称取前处理后的药材10 g，置于250 mL圆底烧瓶中，按照正交表所列出的工艺条件在水浴锅中回流提取。过滤，合并每次试验的提取液，浓缩至10 mL左右，加4倍量的95%乙醇醇沉，静置24 h，得沉淀部分。沉淀用适量无水乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤，干燥，得粗多糖。每组样品平行3次。
2.3.3 后处理(纯化粗多糖) Sevag法去蛋白：用5 mL水溶解粗多糖，加入氯仿-正丁醇(4∶1)，在磁力搅拌器上搅拌15 min， 3 000 r/min离心15 min，除去两相界面处的蛋白质，循环操作数次，直到界面处无蛋白相。装样于处理后透析袋中，在蒸馏水中透析3 d，每隔6 h换水1次。透析好后将样品放于培养皿里面，冷冻干燥12 h，得精多糖。
2.3.4 透析袋前处理 把透析袋剪成长度为15 cm左右的小段，相继在500 mL的2%(W/V)碳酸氢钠和1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10 min，用蒸馏水清洗透析袋3次，放在1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10 min，冷却后存放于1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时戴手套，用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。
2.4 多糖含量的测定
2.4.1 苯酚-硫酸法显色条件 精密量取葡萄糖标准溶液2.0 mL至4个25 mL比色管中，分别加入2.0、4.0、6.0、8.0 mL 5%苯酚溶液，然后加浓硫酸10.0 mL，振荡混匀后加至刻度线，置50 ℃水浴恒温40 min，取出置冷水中冷却，以水为空白，于紫外可见分光光度计上在400～600 nm范围内扫描，并找到最大吸收波长。
2.4.2 标准曲线的绘制 准确移取葡萄糖标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL置于比色管中，分别加入“2.4.1”中苯酚溶液的加入量，摇匀，然后加浓硫酸10.0 mL至刻度线，充分摇匀，50 ℃水浴恒温放置30 min。同时以水做空白，于最大吸收波长处测定吸光度值。
2.4.3 多糖含量的测定 称取精多糖10.0 mg，并定容于10 mL容量瓶中，得多糖储备液1.0 mg/mL。移取多糖储备液1.0 mL，按照上述标准曲线绘制中溶液的操作步骤进行，并测定吸光度值。计算得多糖含量。
2.5 白茅根多糖提取工艺研究
进行提取温度(A)、提取次数(B)、每次提取时间(C)、料液比(D)4因素3水平的正交试验，以多糖量为提取条件的优化指标，选出最佳水平的组合[6]。因素水平和正交方案设计见表1。表1 因素水平表
2.6 白茅根多糖提取优选工艺验证试验
称取药材3份各50 g，按所选条件安排试验，依拟定的方法验证各项指标。
3 多糖的测定结果与分析
3.1 苯酚-硫酸法条件研究
按照“2.4.1”条件进行扫描，结果见图1。
试验发现，加苯酚溶液4 mL时吸光度值最大，而且487 nm处有最大吸光度，且稳定。可见测定的最佳条件是加5%苯酚4 mL，浓硫酸10 mL，选定测定波长为487 nm。
图1 加入苯酚后的紫外光谱图
3.2 葡萄糖标准曲线
以吸光度为纵坐标，溶液的浓度(mg/mL)为横坐标，得回归方程为：A=5.689 3B+0.068 3，r=0.999 6，可见葡萄糖的浓度在0.02～0.14 mg/mL范围内，溶液的吸光度与浓度呈良好的线性关系。
3.3 精密度试验
吸取标准品溶液1.0 mL按照“2.4.2”项下方法操作，连续6次测定其吸收度，分别为0.289、0.291、0.293、0.287、0.285、0.283，求得RSD=1.30%。
3.4 稳定性试验
分别精密吸取白茅根多糖储备液各1.0 mL，按“2.4.3”项下同法操作，分别在0.5、1、2、5、12 h测定，结果分别为0.275、0.273、0.270、0.265、0.260，求得RSD=2.23%，可见多糖溶液在12 h内是稳定的。
3.5 加样回收率试验
准确称取白茅根多糖若干，分别加入葡萄糖标准品若干，加水至10 mL，按“2.4.3”项下同法操作，求得平均回收率值为97.33%，RSD=2.86%，见表2。表2 加样回收率试验结果
3.6 亳州、安国两产地的白茅根多糖含量测定结果
称取亳州、安国两产地白茅根各20 g，按最佳工艺进行提取，得精多糖分别为31.73 mg和32.85 mg，按“2.4.3”项下同法操作测其吸收度，结果为精多糖中多糖含量亳州为91.56%，安国产为96.25%，按照药材进行计算多糖含量分别为0.15%和0.16%。
4 工艺条件研究结果与分析
4.1 正交试验结果与分析
正交试验结果见表3。可见，对白茅根多糖提取的4个因素中，提取次数是决定粗多糖的质量与效率的主要影响因素，其次是温度，而每次提取时间影响较小，料液比对提取效率影响也不明显。从k值中可看出，将4个因素的最优水平结合在一起，得到提取效率最高的组合是B3A2C3D2，即白茅根多糖最佳提取条件是：提取3次，提取温度为85 ℃，每次水提取时间为3 h，料液比为1∶15。表3 多糖提取工艺条件的正交试验方案及其结果
4.2 工艺验证试验
3批50 g白茅根药材经优选工艺处理后多糖含量平均为0.15%，RSD=1.56 %。验证试验结果表明，检测指标高于或接近于正交表中最优值，说明优选的提取工艺条件稳定、可行。
5 讨论
水提醇沉法是多糖的主要提取方法。在白茅根多糖提取过程中，提取次数和提取温度是影响其提取率的显著性因素，最佳工艺条件为：提取温度85 ℃，加入20倍量的水，提取3次，每次3 h。本试验采用苯酚-浓硫酸法[7]测定多糖含量，该法简单、快速、灵敏、重复性好，且生成的颜色持久。用苯酚-硫酸法测定多糖含量时需注意苯酚浓度不宜太高，否则反应的稳定性不好且易产生操作误差。本试验采用5%浓度的苯酚与很多文献报道相符[8]，测定结果较为理想，测定同时保持较高的硫酸浓度，所用葡萄糖标准溶液与白茅根多糖都需现配现用，才能保证结果的稳定性及准确性。
参考文献
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[2] 孙立彦，刘振亮，孙金霞，等.白茅根多糖对小鼠耐缺氧作用的影响[J]. 中国医院药学杂志，2008，28(2)：96-99.
[3] 詹 永，杨 勇.清热保健饮料的研制[J].广东食品工业杂志，2001，17(2)：38.
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