作者：吴皓，水野海腾，吕诚，赵林华，肖诚，林洪生
【摘要】 目的 观察瘢痕灸对肿瘤化疗肠道黏膜损伤的治疗作用及其对黏膜免疫中肠道集合淋巴结(PP结)及固有层中淋巴细胞(LPL)亚群的影响。方法 运用给小鼠原位接种C-26结肠癌并重复灌胃环磷酰胺，建立肿瘤化疗肠道黏膜损伤的模型，瘢痕灸处理17 d，观察瘢痕灸对瘤重、抑瘤率及PP结面积的影响，分离肠PP结内的淋巴细胞，用免疫荧光染色及流式细胞仪分析黏膜免疫各部位T淋巴细胞亚群的变化。结果 环磷酰胺组瘤重显著降低，抑瘤率约为37.59%；环磷酰胺加灸组瘤重与环磷酰胺组比较无统计学意义。荷瘤及环磷酰胺都可显著降低PP结面积，明显增加PP结内CD3+和CD8+细胞百分比，降低LPL中CD4+细胞百分比。而瘢痕灸可明显减轻环磷酰胺对PP结面积的影响(P＜0.01)。瘢痕灸还能使荷瘤和环磷酰胺作用下显著减少LPL中的CD4+细胞百分比显著增加(P＜0.05)，但对LPL中的CD8+细胞百分比及PP结中的CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群无明显影响。结论 荷瘤及环磷酰胺可明显抑制肠道黏膜免疫功能，而瘢痕灸能减轻荷瘤及环磷酰胺对PP结及LPL中某些T细胞亚群的影响，改善黏膜免疫抑制状态。
【关键词】 瘢痕灸；黏膜免疫；肿瘤；环磷酰胺；小鼠
Abstract：Objective To explore the effect of scarring-moxibustion on Peyer’s patch and T cells subsets of intraepithelial lymphocyte of tumor-bearing mice with cyclophosphamide. Method The mucosal immune deficiency model was made by in site inoculating C-26 colon carcinoma with repeated intragastric administration of cyclophosphamide. The mice were treated with scarring- moxibustion for seventeen days after inoculation. The area of Peyer’s patch were measured， and T cells subsets of Lamina propria lymphocyte (LPL) were separated and detected by immunofluorescence test and flow cytometer. Result Tumor weight of tumor-bearing group was higher than cyclophosphamide group significantly (P＜0.01). The tumor inhibition ratio of cyclophosphamide was 37.59%. The area of Peyer’s patch of intestine in tumor-bearing group decreased significantly. The amounts of CD4+ cell of LPL was decreased in the tumor-bearing group and cyclophosphamide group. Scarring-moxibustion could significantly increase the area of PP and the amounts of CD4+ cell of LPL (P＜0.01， P＜0.05)， while had no effect on CD8+ cell of LPL and T cells subsets in Peyer’s patch. Conclusion Scarring-moxibustion can improve the mucosal immune defective caused by tumor and cyclophosphamide.
Key words：scarring-moxibustion；mucosal immunology；tumor；cyclophosphamide；mice
黏膜损伤是癌症常规治疗(即标准剂量化疗)中常见的毒副反应，临床又称黏膜炎。黏膜损伤不但会引起疼痛，严重影响患者的生活质量并降低治疗效果，还是患者并发感染的重要危险因素。因此，近年来黏膜炎越来越受到人们的重视。权威机构发表的报告认为，黏膜炎不仅是放化疗作用于上皮干细胞引
起的局限于黏膜上皮的毒性反应，更是黏膜下的其他细胞和细胞外基质都参加的一个复杂的过程[1]。目前，有关化疗时小肠黏膜屏障功能的病理形态学研究已基本明确，但对于瘢痕灸治疗荷瘤机体化疗所致黏膜炎的黏膜免疫机制还未见报道。本研究以环磷酰胺多次灌胃的荷瘤小鼠为模型，研究瘢痕灸治疗化疗所致黏膜损伤的黏膜免疫机制。
1 实验材料
雌性BALB/c小鼠，3周大，75只，中国医学科学院实验动物研究中心提供，清洁级，体重(16±2)g，许可证号：SCXK(京) 2000-0006。C-26结肠癌瘤株：中国医学科学院药物所韩锐研究员惠赠。FITC标记的抗小鼠CD3，PE标记的抗小鼠CD4， PE-cy5标记的抗小鼠CD8，eBioscience公司产品(购自晶美公司)。
2 实验方法
2.1 分组
随机分为4组：假手术组、荷瘤模型组、环磷酰胺组、环磷酰胺加灸组，每组15只。
2.2 肿瘤细胞接种
选取生长良好的C-26结肠癌瘤组织，按肿瘤(g)∶生理盐水(mL)为1∶3比例匀浆，调整细胞数为5×107/mL。环磷酰胺组及环磷酰胺加灸组小鼠在麻醉状态下打开腹腔，将20 μL C-26肿瘤细胞(共1×106)接种于盲肠浆膜下，缝合腹壁，造成荷瘤C-26结肠癌模型。假手术组在同样条件下开腹，盲肠浆膜下注射20 μL生理盐水。
2.3 给药及施灸方法
假手术组从接种后至处死为止，每日0.9%氯化钠溶液200 μL灌胃。环磷酰胺组及环磷酰胺加灸组从接种后第1－12日，给予0.9%氯化钠溶液200 μL灌胃，第13－17日，每日给予环磷酰胺200 μL(总计量为5 μg)灌胃。在此基础上环磷酰胺加灸组于造模接种次日开始在小鼠背部正中线下1/3处(相当于命门穴处)施治，施灸局部剃毛露出皮肤，使用艾绒制成半米粒大艾炷，放置于穴位相对部位，用线香点燃，每日1壮，连续施治17 d。
实验过程中荷瘤模型组、环磷酰胺加灸组小鼠各有1只死亡，环磷酰胺组小鼠有2只死亡，均死于肿瘤及化疗所致的恶液质。
2.4 检测指标与方法
瘤重及抑瘤率的计算：打开腹腔，剥离肿瘤，称重。
抑瘤率(%)＝(1－实验组的平均瘤重/假手术组的平均瘤重)×100%
记录肠道集合淋巴结(PP结)面积，制备PP结淋巴细胞悬液：取出全部小肠，用含5%NCS的D-Hank’s液冲洗肠腔。肉眼观察PP结，记录个数和面积，并剪下PP结。用机械力挤压的方法得到PP结淋巴细胞悬液，并用300目的尼龙网滤过，去除残留组织和杂质。
小肠黏膜固有层淋巴细胞(LPL)的分离：预热的离心管中加入含有0.1%Ⅱ型胶原酶的1640培养液10 mL。将经过消化液消化振荡后的小肠移入离心管中，放入恒温箱中，于37 ℃孵育40 min。取出离心管充分振荡，用300目的尼龙网过滤。滤液离心1 min(1 000 r/min)，去除上清，加入含5%NCS的1640培养液，调整体积至5.4 mL，再加入100%percoll至9 mL，充分混均后成为40%细胞percoll混悬液，用巴式毛细吸管在试管底部轻轻加入1 mL 70%percoll，使两层液体间形成清晰的界面，制成percoll梯度分离液。600 g、25 ℃离心20 min。收集40%与70%percoll界面间的细胞，用含5%NCS的D-Hank’s培养液洗3次，即为LPL。
分别用FITC、PE、PE-cy5标记的抗小鼠CD4、CD8、CD3单抗对分离的PP结淋巴细胞及LPL进行免疫荧光染色(用量参照产品说明书)。用D-Hank’s将所分离的小肠黏膜淋巴细胞浓度调整为5×106个/mL，按1 μL/106个细胞量加入荧光抗体， 室温下避光40 min，之后用生理盐水洗一遍，上流式细胞仪进行检测。收集4 000个细胞用于数据分析。
3 统计学方法
采用SPSS10.0统计软件，独立样本t检验进行数据分析。4 结果(见表1～表4) 表1 各组小鼠瘤重及抑瘤率比较（略）注：与荷瘤模型组比较，▲▲P＜0.01(下同)表2 各组小鼠PP结面积比较（略）注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与环磷酰胺组相比，##P＜0.01(下同)表3 各组小鼠PP结中CD3+、CD4+及CD8+细胞检测结果（略）表4 各组小鼠LPL中CD4+、CD8+ 细胞检测结果（略）
5 讨论
现代医学研究发现，成人黏膜面积为400 m2，不仅有物理和化学的防护功能，同时也是一个复杂的免疫系统。黏膜免疫系统是由包括肠道、鼻、眼、泌尿生殖道和直肠黏膜及某些外分泌腺(如唾液腺、乳腺等)黏膜相关的淋巴组织共同构成的一个免疫体系。黏膜部位是机体免疫系统的第一道防线，而黏膜免疫系统也是机体中最大的免疫器官。
本实验以环磷酰胺多次灌胃的荷瘤小鼠为模型，研究瘢痕灸治疗化疗所致黏膜损伤的黏膜免疫机制。首先我们观察了各组小鼠的瘤重并计算了荷瘤模型组、环磷酰胺组及环磷酰胺加灸组的抑瘤率，结果表明，环磷酰胺对肿瘤有明显的抑制作用，而瘢痕灸对未经化疗及化疗后的瘤重都无影响。各组小鼠肠道PP结面积的比较显示，荷瘤小鼠受肿瘤影响，肠道PP结的面积明显减少，且随肿瘤的增大而减小。
环磷酰胺组肠道PP结的面积进一步减少，说明环磷酰胺进一步抑制了荷瘤小鼠本已受损的黏膜免疫功能。这与周氏[2]报道的环磷酰胺可诱导PP结数目减少的情况相一致。可见，环磷酰胺可导致肠黏膜免疫功能障碍，而这种功能障碍可能也在化疗所致的黏膜损伤中扮演了重要角色。
临床研究表明，针刺某些穴位不仅可以提高机体免疫反应，增强防病能力，而且能减轻放疗、化疗不良反应，延长患者生存期[3]。黄氏[4]曾观察到化疗后大鼠胃黏膜变薄，胃黏膜浅层上皮均有程度不同的剥脱现象。针刺足三里后针灸组动物肠黏膜上皮坏死较化疗组减轻、表层黏膜剥脱及纤维组织增生率少于化疗组，且病变程度也轻。说明针灸可有效减轻化疗的毒性作用，保护胃肠黏膜。王氏也报道了针灸对化疗引起的胃肠道毒副作用及黏膜炎有良好的治疗作用[5]。本实验结果也显示环磷酰胺加灸组PP结面积明显高于环磷酰胺组，能明显改善LPL中因荷瘤及环磷酰胺化疗导致的CD4+细胞百分比下降，恢复LPL中正常的CD4+细胞百分比。说明瘢痕灸可明显改善环磷酰胺造成的黏膜局部免疫功能严重抑制，这可能是其调节黏膜免疫的作用机制之一。
参考文献
[1] Mucositis：Perspectives and clinical practice guidelines. Perspectives on cancertherapy-induced mucosal Injury. Pathogenesis， measurement，epidemiology，and consequences for patients[J].Cancer， 2004，100(9 Suppl)：1995－2025.
[2] 周 华，王培训，刘 良，等.环磷酰胺对小鼠Peyer’s结和肠道黏膜相关淋巴细胞的影响[J].中国免疫学杂志，2000，17(4)：186－189.
[3] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003.195.
[4] 黄 峥.癌症的针灸治疗[J].湖南中医药导报，1997，4(8)：54－55.
[5] 王守章.针刺控制化疗所致胃肠反应临床研究[J].中国针灸，1997， 17(1)：17.