作者：何倩，周小青，李花，刘旺华，刘建新
【摘要】 目的 探讨丹龙醒脑片对大鼠脑缺血再灌注后海马区神经细胞凋亡和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响，探讨其作用机制。方法 应用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，用原位末端标记法和免疫组化法分别检测假手术组、模型组、丹龙醒脑片组和尼莫地平组的凋亡细胞数和TNF-α阳性细胞数。结果 与假手术组相比，模型组凋亡细胞数和TNF-α表达明显升高(P＜0.05，P＜0.01)；与模型组相比，丹龙醒脑片组凋亡细胞数和TNF-α表达明显降低(P＜0.05)。结论 TNF-α表达下降可能是丹龙醒脑片减少大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的分子机制之一。
【关键词】 脑缺血再灌注；丹龙醒脑片；细胞凋亡；肿瘤坏死因子α；大鼠
Abstract：Objective To study the effects of Danlong Xingnao Tablet on neuronal apoptosis and expression of TNF-α after focal cerebral ischemia reperfusion in rat hippocampus. Methods The model of middle cerebral arteries occlusion (MCAO) were performed with intraluminal filament blockade. By using in situ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotor nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemistry staining， the number of apoptotic cells and TNF-α positive cells were detected in the sham-operated group， the ischemia reperfusion group， Danlong Xingnao Tablet group and nimodipine group after the middle cerebral arteries of SD rats occluded for 1 h and reperfused for 24 h．Results Compared with the sham operation group， the number of apoptotic cells and TNF-α positive cells of the model group increased significantly (P＜0.05， P＜0.01). Compared with the model group， DLXNT intragastric administration could reduce the number of apoptotic cells and TNF-α positive cells (P＜0.05). Conclusion The decreased expression of TNF-α may be one of the molecular mechanisms of decreased apoptotic cell after rat cerebral ischemia reperfusion injurying treated with Danlong Xingnao Tablet．
Key words：cerebral ischemia reperfusion；Danlong Xingnao Tablet；apoptosis；TNF-α；rat
丹龙醒脑片是临床治疗缺血性卒中的有效复方。以往的研究证实，丹龙醒脑片具有增加脑组织局部血流量、抗神经细胞凋亡等作用[1-3]。在局灶性脑缺血再灌注后存在大量的神经细胞凋亡，尤其在缺血半暗带区及对缺血较为敏感的海马区。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是凋亡诱导家族的重要成员之一，本实验选用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，观察丹龙醒脑片对脑缺血再灌注后海马区TNF-α蛋白表达的影响，探讨丹龙醒脑片抗局灶性脑缺血再灌注神经细胞凋亡、减轻病理性损伤的机制。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级SD大鼠72只，雌雄各半，体重280～300 g，中南大
学湘雅医学院动物学部提供，合格证号：医动字第20-010号。
1.2 药物
丹龙醒脑片由丹参10 g、三七6 g、地龙6 g、远志8 g、淫羊藿8 g、菟丝子8 g组成，原药材购自湖南中医药大学附属第一医院药房，湖南中医药大学药学院药剂教研室制成片剂，批号070615。0.4 g/片，每片含原药材4 g。用时研细，加蒸馏水配成所需浓度混悬液。尼莫地平由正大青春宝药业有限公司生产，批号070825，每片20 mg，临用前将胶囊去壳，内容物用蒸馏水配成混悬液，按人鼠体表面积换算，1 mL/100 g体重灌胃给药，剂量为10.8 mg/kg。
1.3 主要试剂和仪器
多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)为武汉博士德生物有限公司提供，批号06052109。水合氯醛购自白鹤化工厂，批号20060924。单尼龙线(直径0.26 mm)为市售，使用前剪成5 cm长的线段，筛选出前端光滑、钝圆、大小一致者，于2 cm处作好标记，前段3 cm浸入0.1% Poly-L-Lysine(w/v)，5 min自然晾干，临用前在前端蘸取肝素。马头牌GPS型双极电凝器(上海医用激光仪器厂生产)；彩色图像分析系统(Optimas，美国)。
2 实验方法
2.1 分组及给药
大鼠按性别、体重分层，随机分为4组，即假手术组、模型组、丹龙醒脑片组、尼莫地平组，每组各18只大鼠，雌雄各半。灌胃给药，灌胃体积为1 mL/100 g体重，从手术前3 d开始，每日1次。造模当日于手术前1 h给药，再灌注后20、40 h各给药1次。丹龙醒脑片组为4 g/kg体重；尼莫地平组剂量为10.8 mg/kg体重；假手术组和模型组每日灌胃等量蒸馏水。
2.2 模型制备
参照文献[4]方法采用左侧颈内动脉单尼龙线线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，并予以改进。术前禁食12 h，自由饮水。实验前腹腔注射10%水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉，仰卧位固定，用烤灯维持肛温在36.5～37 ℃，防止低温对脑缺血的影响。取颈正中切口，分离暴露左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉和翼颚动脉。结扎翼颚动脉，在距颈动脉叉1 cm处结扎颈外动脉，并于结扎处远心端用电凝器灼断以游离颈外动脉。动脉夹夹闭颈总动脉，提起颈外动脉游离端使其与颈内动脉成一直线，于颈外动脉结扎处近心端约0.5 cm处剪一切口，将线栓蘸取肝素后，由切口向颈内动脉插入至有轻微阻力感停止，平均距离(18.0±0.5)mm，固定线栓，阻闭1 h后再灌注47 h。手术后动物保温(28 ℃左右)饲养。假手术组仅结扎颈外动脉、翼腭动脉，不插入线栓。以清醒后前肢出现腕曲、肩内旋、前进时向右侧转圈、歪倒及Horner征为模型成功的判断标准，不成功者剔除。
2.3 样本采集与处理
实验结束，断头取出脑组织，去除脑干和小脑，正中矢状切开分离出缺血侧大脑半球，置福尔马林溶液中浸泡固定3～5 d，检测时取出，常规石蜡包埋切片，厚5 μm，取视交叉后1～4 mm脑组织行冠状切片。
2.4 指标检测
2.4.1 海马区凋亡细胞检测
采用原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡神经细胞。原位细胞凋亡检测盒，中山生物工程有限公司提供，批号TBD2020POD。将提取标本进行常规石蜡包埋切片，厚5 μm，苏木素-伊红(HE)染色，低倍镜(10×4)确定海马区位置，高倍镜(10×40)观察海马区细胞形态、大小、染色情况，经图像分析仪(每个切片随机选择5个视野)观察，计算细胞凋亡指数(Apoptosis Index，AI)，结果取均数。AI(%)＝凋亡细胞数/总细胞数×100%
2.4.2 海马区神经细胞肿瘤坏死因子α基因蛋白表达
免疫组化采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法，测定凋亡相关基因TNF-α蛋白(TNF-α免疫组化染色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，批号BA0131，操作按试剂盒说明进行)。光镜下观察阳性细胞浆或细胞核着色呈棕黄色，切片于光镜下400倍放大，经图像分析仪(每个切片随机选择5个视野)观察，检测阳性细胞数，取平均数作为海马区神经细胞TNF-α基因蛋白的表达。
3 统计学方法
计量资料用x±s表示，用SPSS14.0版统计软件进行统计，多组间比较用方差分析，两两比较方差齐时用LSD检验，方差不齐时用Dunnett’s T3检验。
4 结果
(见表1)表1 各组大鼠海马区AI、TNF-α阳性细胞数的比较(略)注：与假手术组比较，※P＜0.05，※※P＜0.01；与模型组比较， △P＜0.05，△△P＜0.01
5 讨论
作为体内一种十分重要的多效细胞因子，TNF-α是机体炎症和免疫应答的重要介质。越来越多的研究表明，TNF-α参与了缺血性脑损伤机制，且主要起破坏作用。正常人血液和脑脊液中TNF-α含量极微。但动物实验和临床研究发现，脑缺血后外周血和脑脊液中TNF-α水平均明显升高。Zaremba等[5]认为，脑脊液中TNF-α的增高不是外周血中TNF-α通过受损的血脑屏障引起的，而主要是脑缺血诱导激活的神经元、胶质细胞和巨噬细胞等产生的。卒中后，血中TNF-α增高属于早期卒中诱导的全身炎症反应，脑脊液中TNF-α增高为脑组织合成增加所致[6]。
由于TNF-α参与了缺血性脑损伤机制，且主要起破坏作用，因此，研究抑制TNF-α在缺血性脑损伤中表达的药物成了当前的热点，尤其是中医药对脑缺血动物模型TNF-α的抑制作用的研究。大量实验研究表明，中医药对脑缺血中TNF-α的表达确有抑制作用[7-9]。本实验采用线栓法造成脑缺血模型，用免疫组化法检测细胞凋亡相关蛋白TNF-α表达的变化。研究发现，假手术组无细胞变性与坏死，仅见少量凋亡阳性细胞；模型组凋亡相关蛋白TNF-α表达明显增多，有明显脑组织坏死，脑细胞凋亡增多；丹龙醒脑片组脑细胞凋亡及坏死明显减轻，与模型组比较，凋亡相关蛋白TNF-α表达明显减少。结果表明，丹龙醒脑片通过抑制TNF-α表达而有效减轻脑细胞损伤，对急性脑缺血有显著保护作用。
参考文献
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