作者：田茸，张士卿，史正刚，慕宝龙
【摘要】 目的 通过免疫组织化学方法分析平痫冲剂对戊四唑(PTZ)致痫大鼠海马氨基酸类神经递质受体的影响，探讨其抗癫痫的作用机理。方法 将60只28日龄的Wistar大鼠随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、苯巴比妥组(C组)及平痫冲剂小(D组)、中(E组)、大(F组)剂量组。除正常对照组外，其余各组大鼠腹腔注射PTZ复制慢性癫痫模型，通过免疫组织化学方法和显微图像分析技术分别检测各组大鼠海马CA1、CA3的谷氨酸受体(NMDAR1)和γ-氨基丁酸受体(GABA-ARα1)免疫反应的阳性细胞数(n)、阳性细胞面积比(Aa%)及阳性细胞积分吸光度(IA)。结果 与A组比较，B组海马CA1、CA3等部位NMDAR1的n、Aa%上升，IA增加(P＜0.01)；与B组比较，C组及D、E、F组不同部位NMDAR1的n、Aa%都有不同程度下降，IA也有不同程度减少(P＜0.05)。同A组比较，B组海马CA1、CA3等部位GABA-ARα1的n、Aa%下降，IA降低(P＜0.01)；与B组比较，C、D、E、F组不同部位GABA-ARα1的n、Aa%都有不同程度增加，IA也有不同程度升高(P＜0.05)。结论 平痫冲剂抗癫痫的作用机理可能是通过抑制海马兴奋性神经递质受体NMDAR1的活性与表达，并激活其抑制神经递质受体GABA-ARα1的活性与表达，从而降低大脑皮质的兴奋性，有效抑制癫痫的形成及发展。
【关键词】 癫痫；平痫冲剂；谷氨酸受体；γ-氨基丁酸受体；大鼠
Abstract：Objective Though immunohistochemical study on the effects of Pingxian Powder on N-methyl-D-aspartate receptor1 (NMDAR1) and γ-aminobutyric acid-A receptor α1 (GABA-AR α1) in central nervous system of pentylenetetrazol-induced epileptic rats， to explore its possible antiepileptic mechanism. Methods Sixty wistar rats were pided into control group (A)， model group (B)， phenobarbital group (C) and Pingxian Powder small (D)， middle (E)， Large (F) dosage group. Pentylenetetrazole (PTZ) was injected into abdomen of rat to reconstruct epileptic kindling model. The total number， percentage of positive area and integral optical density of NMDAR1 and GABA-AR α1 of immunoreactive cells in hippocampus CA1， CA3 were studied by the immunohistochemical method and image analyzing system. Results The total number， percentage of positive area and integral optical density of NMDAR1 of immunoreactive cells in hippocampus formation of Group B were more than Group A (P＜0.01)， while these numerical values of Group C， D， E， F decreased to varying degrees compared with Group B (P＜0.05). The total number， percentage of positive area and integral optical density of GABA-AR α1 of immunoreactive cells in hippocampus formation of Group B were less than Group A (P＜0.01)， while these numerical values of Group C， D， E， F enhanced to varying degrees compared with Group B (P＜0.01， P＜0.05). Conclusions Pingxian Powder may reduce the excitability of cerebral cortices by inhibiting the activities of NMDAR1 and promoting the activities of GABA-AR α1 in hippocampus to inhibit the formation and development of epilepsy.
Key words：epilepsy；Pingxian Powder；NMDAR；GABA-AR；rat
癫痫是一种常见的慢性脑部疾病，在我国，癫痫患者约占人口总数的5‰，其中儿童癫痫的发病率约为成人的10倍，且半数以上在10岁以内发病。尽管有许多有效的抗癫痫西药，但仅对70%左右的患者有效，且长期服药不良反应较多。前期实验研究表明，平痫冲剂可以有效抑制戊四唑(PTZ)致痫大鼠大脑颞叶皮质及海马齿状回谷氨酸受体(NMDAR1)的活性与表达，并激活γ-氨基丁酸受体(GABA-ARα1)的活性与表达[1-2]。本实验通过检测大鼠海马CA1、CA3区氨基酸类神经递质受体的含量，从另一个研究靶区探讨平痫冲剂对癫痫的治疗效果及作用机理。
1 实验材料
Wistar大鼠，体重(70±10)g，雌雄各半，甘肃省实验动物研究中心提供，合格证号：医动字第14-007号。免疫组化试剂盒(SABC法)，武汉博士德公司提供；PTZ用前以生理盐水配制成溶液，浓度为2.5 mg/mL；平痫冲剂(胆南星、白僵蚕、天麻、代赭石、丹参等)，用时煎煮浓缩；苯巴比妥浓度为1.03 mg/mL。
2 实验方法
2.1 分组
将60只28日龄的Wistar大鼠适应性饲养4 d后，随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、苯巴比妥组(C组)及平痫冲剂小(D组)、中(E组)、大(F组)剂量组，每组10只。
2.2 戊四唑点燃大鼠模型的制备
除正常对照组外，其余5组均参照文献[3]方法制备癫痫点燃模型。凡连续5次显示Ⅱ级以上惊厥的，则视为达到点燃标准，Ⅳ～Ⅵ级的痫性行为被视为充分点燃。大鼠惊厥发作采用七点评分法为标准[3]。0级：没有行为上的发作；Ⅰ级：节律性点头或头部颤搐；Ⅱ级：阵挛性咀嚼；Ⅲ级：头部颤搐加前肢阵挛性抽搐；Ⅳ级：袋鼠姿势(上身直立)；Ⅴ级：跌倒；Ⅵ级：全身强直阵挛性惊厥。
2.3 给药
造模成功1 d后，除正常对照组和模型组外，其余各组开始灌服药物。平痫冲剂用时煎煮浓缩，灌胃剂量按人与大鼠体表面积比[4]，折算成大鼠等效剂量，每日按4 mL分别灌服平痫冲剂水溶液，浓度分别为低剂量组1.4 g/mL、中剂量组3.3 g/mL、高剂量组6.7 g/mL，分别相当于20 kg体重的6岁儿童临床用量的5、10、20倍；苯巴比妥组每日按4 mL灌服苯巴比妥浓度为1.03 mg/mL；正常对照组和模型组灌服等体积的生理盐水。每日灌胃1次，连续灌胃3周。
2.4 取材
该6组大鼠在相同条件下用乙醚吸入麻醉，四肢固定在手术板上，开胸，暴露心脏，直视下将穿刺针经左心室刺入，并以止血钳固定，然后剪开右心耳，随即用4 ℃预冷的生理盐水250 mL快速灌注，再灌注含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液500 mL。先灌注再改为滴注，调节滴速，先快后慢，滴注时间为1 h，观察大鼠全身僵硬后，迅速开颅取出完整大脑，去除脑干及小脑部分，将修整后的脑组织块置于上述滴注液内4 ℃过夜，再置于200 g/L蔗糖中12 h。然后每个大脑半球以背侧海马最大断面处切取3 mm厚的组织，随后制成石蜡包块，再做冠状切片，厚度为4 μm。
2.5 免疫组化染色
采用SABC法，按照试剂盒说明书操作。
2.6 图像分析
所有切片放大倍数均为100，测量窗面积为171 814 μm2。分别检测大鼠大脑海马CA1、CA3 GABA-ARα1、NMDAR1的免疫阳性反应细胞。每部位取2个视野，测量同一视野的阳性细胞数、阳性细胞积分吸光度、阳性细胞面积比，并分别取其平均数进行统计学分析。
3 统计学方法
结果用SPSS 11.0统计软件处理。进行方差分析，组间进行两两比较，实验数据以x±s表示，以α＝0.05为显著性水准。
4 结果
(见表1～表4)表1 平痫冲剂对PTZ致痫大鼠海马CA1区NMDAR1免疫阳性细胞的影响(略)注：与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较，#P＜0.01；与E组比较，△P＜0.05；与F组比较，★P＜0.01(下同)表2 平痫冲剂对PTZ致痫大鼠海马CA3区NMDAR1免疫阳性反应细胞的影响(略)表3 平痫冲剂对PTZ致痫大鼠海马CA1区GABA-ARα1免疫阳性反应细胞的影响(略)表4 平痫冲剂对PTZ致痫大鼠海马CA3区GABA-ARα1免疫阳性反应细胞的影响(略)
5 讨论
平痫冲剂选取胆南星、白僵蚕、天麻、代赭石、石菖蒲、丹参、白芍等为主要治疗药物，以化痰活血、熄风定痫为根本大法，治疗癫痫临床疗效颇为显著。本实验选用PTZ点燃致痫模型，被公认为是理想的癫痫动物模型，其致痫性增高且具有永久的保留能力，并较好地模拟了人类癫痫的进行性发展和长期反复的自限性发作形式。其优点在于：制作方便，成功率高；不受麻醉剂和手术过程的影响，便于全面观察动物惊厥发作；所需仪器设备简单，容易推广；不破坏局部脑组织的结构，不伴有神经元损伤、坏死[3]。故有利于进一步开展脑组织各项指标的检测，尤其适用于癫痫脑组织形态学的观察。本实验选NMDAR1和GABA-ARα1为检测指标，因其是兴奋性和抑制性氨基酸类神经递质受体的代表，是研究癫痫的传统指标，具有非常重要的研究价值。本实验结果显示，平痫冲剂的大、中、小剂量及苯巴比妥均能有效抑制NMDAR1的活性及表达；而其中平痫冲剂中剂量对NMDAR1表达的抑制作用最强。故提示用中剂量的平痫冲剂能较为有效地抑制致痫大鼠海马CA1、CA3兴奋性氨基酸神经递质受体NMDAR1的活性及表达。平痫冲剂的大、中、小剂量及苯巴比妥均能有效促进GABA-ARα1的活性及表达；而其中平痫冲剂中剂量对GABA-ARα1表达的促进作用最强。故提示用中剂量的平痫冲剂能较为有效地提高致痫大鼠海马CA1、CA3抑制性氨基酸神经递质受体GABA-ARα1的活性及表达。
综上所述，平痫冲剂是通过抑制颞叶皮质兴奋性神经递质受体NMDAR1的活性及其表达，并提高其抑制性神经递质受体GABA-ARα1的活性与表达，从而提高癫痫发作阈值，降低大脑皮质的兴奋性，抑制癫痫的形成及发展，发挥抗癫痫的作用。
参考文献
[1] 张士卿，田 茸，史正刚.平痫冲剂对戊四唑致痫大鼠颞叶谷氨酸受体和γ-氨基丁酸受体的影响[J].中国中医药信息杂志，2007，14(4)：29－30.
[2] 田 茸，慕宝龙.平痫冲剂对PTZ致痫大鼠中枢神经系统NMDAR1和GABA-ARα1的影响[J].中医儿科杂志，2006，2(6)：24－25.
[3] 徐国龙，杨 帆，章复清，等.柴胡加龙骨牡蛎汤对PTZ点燃型癫痫大鼠脑内氨基酸含量的影响[J].中国医药学报，2002，17(3)：165－167.
[4] 黄继汉，黄晓辉，陈志扬.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J].中国临床药理学与治疗学，2004，9(9)：1069－1072.