作者：刘雅 李淑惠 李晓辉 张海港 周见至 贾乙
【摘要】 ：目的 探讨气虚血瘀证的炎症免疫分子机理。方法 12只大鼠随机分为气虚血瘀模型组和正常对照组。应用全基因芯片对气虚血瘀大鼠和正常大鼠进行全基因表达谱检测，分析与炎症免疫相关的差异表达基因。结果 气虚血瘀模型组较正常组大鼠表达上调的基因有831个，已知功能的基因563个；表达下调的基因782个，已知功能的基因544个。在已知功能基因中，与炎症免疫反应相关的表达上调的基因50个，表达下调的基因17个。结论 炎症免疫相关基因的差异表达揭示出气虚血瘀证与异常的炎症免疫反应密切相关。
【关键词】 气虚血瘀证 动物模型 基因芯片 炎症 免疫反应
Abstract：Objective To investigate molecular biological basis associated with inflammatory and immune response in Qi deficency and blood stasis syndrome. Methods Twelve rats were randomly pided into model group and control group. Rat Genome 230 2.0 Array Gene Chip was used for examination of gene expression profiles in rats with Qi deficiency and blood stasis syndrome and normal rats. Differental expression genes associated with inflammatory and immune mechanism were analyzed. Results Compared with the control group， there were different expression genes in model group， the up-regulated were 831 genes， known functional genes 563， and down-regulated 782， known functional genes 544. The expression level increased in 50 genes and decreased in 17 genes associated with inflammatory and immune response. Conclusion Differental expression genes associated with inflammatory and immune response revealed that there was close correlation between Qi deficency and blood stasis syndrome and abnormal inflammatory and immune response.
Key words：Qi deficency and blood stasis syndrome；animal model；gene chip；inflammation；immune response
本实验利用全基因芯片技术，通过对气虚血瘀大鼠和正常大鼠基因表达谱的差异分析，首次揭示气虚血瘀证炎症免疫机理的分子生物学基础，为探求气虚血瘀证关键基因群及明确其功能奠定基础。现报道如下。
1 实验材料
1.1 动物
雄性SD大鼠，体重(200±20)g，中国人民解放军第三军医大学实验动物中心提供。合格证号SCXK(渝20070002)。
1.2 主要试剂及仪器
TRIzol购自Invitrogen公司，DEPC购于Sigma公司， RNeasy Micro Kit为Qiagne公司产品，基因芯片扫描仪为Affymetrix公司产品。
2 实验方法
2.1 造模
将12只大鼠随机分成气虚血瘀模型组和正常对照组。模型组采用饥饿、疲劳等综合因素造成大鼠气虚血瘀模型。第1周限制大鼠食入量(摄食正常1/3量)，第2周开始强迫大鼠游泳(水温14～16 ℃)，待疲劳时捞出水面，每日1次，连续3周[1]。对照组每日正常饮食。
2.2 基因芯片实验
2.2.1 总RNA提取及纯化
第4周末，大鼠麻醉后在无菌条件下腹主动脉抽血1 mL，采用Trizol一步法抽提全血总RNA，操作参照说明书进行。抽提总RNA的质量及纯度采用1%琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测分析。然后用RNeasy Micro Kit试剂盒纯化总RNA，具体操作按说明书进行。纯化后的总RNA经紫外分光光度计检测，A260/A280吸收率为1.8～2.0时说明RNA质量较好，并根据A260值(A260＝1时RNA为40 mg/L)计算RNA浓度。每组6只大鼠全血总RNA等比例混合。
2.2.2 芯片实验
用One-cycle cDNA Synthesis Kit (Affymetrix公司)将总RNA逆转录成双链cDNA，后经GeneChip IVT Labeling Kit(Affymetrix公司)以cDNA为模板合成标记的cRNA经纯化及片段化处理(处理为35～200 bp)后，取cRNA片段15 g配制杂交液，与Rat Genome 230 2.0 Array GeneChip (28 000个基因，Affymetrix公司)在杂交箱中杂交16 h。取出芯片，去除杂交液，加入漂洗缓冲液直至芯片舱充满，对芯片进行洗脱和染色。在芯片扫描仪上扫描芯片信息。
2.2.3 结果分析
采用GCOS1.4软件处理数据，将芯片所有探针组的Signal从小到大排序，去掉最大的2%和最小的2%后，将剩下探针组的平均信号值调整到500。用管家基因进行数据的归一化处理。数据进一步处理用Excel进行。
3 结果
3.1 造模大鼠一般状态的变化
模型组大鼠表现出倦怠少动，活动无力，过劳(游泳)后气短喘息，毛色枯槁、杂乱，大多数大鼠尾绀稍凉，体重明显下降。对照组大鼠活动灵活，毛色洁白光泽，未见尾绀稍凉，体重逐渐增加，无其他异常表现。
3.2 基因芯片结果分析
3.2.1 基因表达差异散点图
散点图显示，检测信号强的基因超出2倍线较少，而检测信号处于边缘值、检测信号很弱的基因因其检测信号值基础较低，故超出的基因较多，所以会造成较多的假阳性。因此在以后的分析中我们主要选择检测信号强的基因进行数据分析。
3.2.2 基因差异表达统计分析
我们用以下2个条件为判断基因差异表达的标准[2]：①信号比值&>2.0为表达上调，&<0.5为表达下调。②在两个比较的信号值其中之一信号检出值必须为P。结果气虚血瘀模型组较正常组表达上调(倍数&>2.0)的基因有831个，其中已知功能的基因563个，268个未知功能或是EST标签，表达下调(倍数&<0.5)的基因有782个，其中已知功能的基因544个，未知功能的基因或为EST标签238个。
3.2.3 与炎症免疫相关的差异表达基因
在已知功能基因中，与炎症免疫反应相关的表达上调的基因49个，表达下调的基因17个，包括介导细胞因子的生成、免疫反应的调节、炎症反应、免疫反应、信号转导等生物功能(见表1、表2)。表1 气虚血瘀大鼠炎症免疫相关表达上调的基因（略）表2 气虚血瘀大鼠炎症免疫相关表达下调的基因（略）
4 讨论
“证”本质的研究是中医药学的核心问题之一。多年来尽管人们对其从整体行为、系统组织、细胞病理等角度进行了多层次的探索，但迄今为止仍无根本性突破[3]，“证”本质研究的明显滞后已成为严重限制中医药学发展的瓶颈因素。目前，功能基因组学技术的发展使从基因水平探求证本质成为可能。基因芯片技术可以高效率、高通量地对比两种不同样品的杂交信号，其检测的基因表达谱变化是基于mRNA转录水平的变化，可以从数万个基因中筛选出被上调或下调的差异表达基因，进而从差异表达基因中寻找关键基因的候选基因群。本研究基于中医基础理论，利用过劳、寒凉和摄食不足等多因素复制的气虚血瘀大鼠模型的证候表现基本符合气虚血瘀证的表现。利用Affymetrix全基因组芯片对气虚血瘀大鼠与正常大鼠的全基因表达谱进行比较，结果显示许多细胞因子、细胞组分及转录调节分子等基因表达发生改变，它们参与了代谢、运动、生殖、反应、调节等多种生物过程。我们重点对与炎症免疫相关的差异表达基因进行了分析。
在已知功能的差异表达基因中，与炎症免疫反应相关的基因，按生物学功能分类包括细胞因子的生成、免疫反应的调节、炎症反应、免疫反应、信号转导等。其中上调的基因50个，如白细胞介素1β(interleukin 1 beta，IL-1β)介导IL-6的生成，IFc受体(Fc receptor)使肿瘤坏死因子的表达增多， IL-18和IL-1β直接使趋化因子增加；CD3、CD69抗原升高代表活化T细胞及其介导的细胞免疫增强；而整合素(integrin) 家族的基因表达如integrin beta 2、integrin， alpha 6、integrin beta 1以及凝血因子5(coagulation factor 5)等增强了细胞粘附功能。所有上调的与炎症免疫反应相关的基因使促炎因子产生增加，机体炎症反应加剧，免疫应答紊乱。与炎症免疫反应相关的差异表达基因下调的有18个，如CD59抑制补体活化，STAT5B(signal transducer and activator of transcription 5B)调节IL-2的生成。IL-2与IL-2受体结合，通过STAT和MAKK(mitogen activated protein kinase kinase)等信号通路活化T细胞，增强对杀伤细胞的杀伤功能和辅助抗体生成，在免疫应答中起重要作用。无论上调还是下调的基因，最终促使机体炎症反应发生，免疫功能下降，组织损伤加重。炎症免疫相关基因的差异表达揭示出气虚血瘀证与异常的炎症免疫反应密切相关，为研究气虚血瘀证本质炎症免疫机制提供了候选基因群。我们将进一步筛选证相关关键基因并鉴定其功能，从而从功能基因组学这一全新的角度和生命的根本层次阐释气虚血瘀的分子基础，为其他证本质的研究提供新的思路。
【参考文献】
[1] 庞树玲，高金亮.中年大鼠气虚血瘀证的模拟及其机理探讨[J].天津中医学院学报，1997，16(3)：28－30.
[2] 王永煜，张幼怡.基因芯片数据分析与处理[J].生物化学与生物物理进展，2003，30(2)：321－323.
[3] 李翠娟，烟建华.证本质研究的新思路探讨[J].中国中医基础医学杂志， 2004，10(11)：28－30.