关于用甘油作保护剂制备胆固醇三联酶液及胆固醇试剂的推广应用

用酶试剂测定血清总胆固醇(TC)是IFCC推荐的方法，县有简易、快速、精密，特异性好，适应于自动或半自动生化分析仪及各类分光光度计等优点，在我国正在逐步取代强酸显色剂。全面推广使用TC酶法分析，胆固醇酯酶(CEH)和胆固醇氧化酶(COD)需要有优质，价廉，充足的供应来源。上海医药工业研究院及河北省科学院微生物研究所研制的这两种酶，虽可达到常规生化检验的要求，但不能满足供应，所以我们引进了Boehinger公司CEH、COD，用甘油作保护剂制备了胆固醇三联酶液，设计以Trinder反应。)为基础的改进的TC测定法。液体胆固醇酶试剂减少了在制备过程中(如冻干球磨)酶活性的损失，保证了酶试剂质量，降低了成本。
材料和方法
　　1.酶及试剂
　　(1)CEH、COD系西德Boehringer产品，CEH13300u/g(25℃)，COD3580μ/g(25℃)；辣根过氧化物酶(HRP，R11.5～2)上海华美生物工程公司产品，200u/ng(25℃)。
　　(2)Kh3PO4、Na2HP4、12h3O及酚类均为喻尔滨市化工试剂厂产品；聚乙二醇辛基醚(乳化剂OP)为东湖塘化学试剂厂；4-氨基安替比林(4AAP)为上海试剂一广产品；甘油为吉林省军区化工厂产品；胆酸钠为Serra产品；胆固醇亚油酸酯为 Sigma产品，纯度99％。
　　(3)作对比研究用的酶试剂有美国BecRman、意大利Sdaro胆固醇试剂盒。
　　2.仪器
　　岛律LKB-260紫外分光光度计，IL公司M-10，MoA全自动生化分析仪及美国 ENCOR离心式自动生化分析仪；上海县曹行无线电原件厂81.2型磁力恒温搅样器。
　　3.实试方法
　　(1)试剂配方选择：
　　三联酶液：每升甘油PBS(PH7.2)酶稀释液中含CEH≤750u，COD≥750u， HRP≥5000u，在2-8℃环境中磁力搅拌2小时，分装安瓶(1ml/瓶)，在-20℃环境中可保存2年，在2-8环境中可保存半年。
　　基础缓冲液：每升Kh3PO4-Na2HP4缓冲液中(PH7.2，2mmol/L)含胆酸钠3 mmol；4 AAP0.5mmol，0.5％OP乳化剂及适当的防腐剂。
　　酚试剂：每升无离子水中含苯酚3 mmol(1.5/瓶)。
　　标准液：Bekmom水溶性胆固醇标准液(5.2mmol/L)。
　　(2)TC测定：
　　将三联酶液与酚试剂，基质缓冲液按1：1.5：60比例混合，放置10分钟待用。测定 TC时血清及标准液与TC酶试剂按1：75比例混合，37℃保温11.5分钟后，以光度计测吸光度(波长505nm)。
若用离心式自动生化分析仪，三联酶液，酶试剂及基质缓冲液2：1.5：60比例混合，血清与试剂比例不变(1：75)
　　(3)米氏常数(Km)的测定：
　　胆固醇亚油酸酯作底物，浓度为8×10-3-14.5×10-3mmol/L，在COD足够的条件下与CEH作用时在波长240nm检测△+胆甾稀酮的生成速度。以反应初速度与底物浓度按双倒数法(Line Wearer Burk法)作图求Km值。
实验结果
　　1.酶促反应的速度及显色稳定性
　　在酶偶联反应过程中，反应速度主戛取决于扁动酶(CEH)的特性，采用充足的COD和HRP活力与合适的显色反应条件，按离心式自动生化分析仪所选则的试剂与血清比例混合37℃环境6分钟反应已达到终点，其吸光度在60分钟内可保持不变。而Beckman、Sdavo试剂反应达到终点的时间分别为3分、5分。
　　2.温度对反应速度的影响
　　用Boehringer CEH与COD所制备酶试剂显色反应在37～55℃范围内随温度升高(25、30、37、40、45、50、55℃)而速度加快(15.8、6、6、5、4、3、5分钟)自终点吸光度相同(A0.452-0.471/505nm)。
　　3.Boehringer CEH的Km值
　　为测准胆固醇亚油酸酯水解速度不用HRP及显色剂，减少CEH用量，直接测定胆固醇的氧化产物△+胆甾烯酮，由此测出此酶的Km为6.28×10-5。 　　4.胆固醇三联酶液保护剂的选择
　　乙二醇和甘油作为质控血清的标定剂，甘油作硷性磷酸酶的保护剂均早巳有报导，Z二醇作稳定剂得美国专利后被广泛采用。甘油又称丙三醇，与乙二醇化学性质相近，并有相似的粘质和吸水特性，甘油取材方便。用甘油作三联酶液的保护剂，三联酶液在-20℃环境保存致少可稳定2年，在-2℃可稳定6个月。
　　5.酶激活剂的作用
　　胆盐和镁离子均是CEH激活剂，由于我们采用PBS，加入镁离子可形成不溶性沉淀，故本试剂中只加少量的胆酸钠。表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚有使样品中胆固醇酯从酯蛋白颗粒中释放出来的作用，加入少量能促进酶反应，但用量超过0.5％时对酶有抑制作用。
　　6.线性实验
　　血清中TC在12.7mmol/L以下与本系统反应的吸光度变化有良好的线性关系，回归方程y=5.8×10-3+1.31×，与Beckman试剂基本一致。
　　7.精密度与回收试验
　　TC测定批内，批间CV均≤2％。血清加入胆固醇1.07、2、15、3、24、4.078mmol/L后，回收率分别为102.88、103.55、103.84、95.03，平均回收率为102.0％。
　　8.对比实验
　　采用同一份标本，用本文试剂与某些进口试剂对比结果见表3。可见P&>0.01本试剂与进口试剂无显著性差异。
讨论
　　1.本法在测定血清TC中的应用
　　本文参考IFCC推荐的方法，酶法检测血清中TC浓度是国外普遍采用的方法之一，具有标本量少，精密度较高的特点。同时本法还有方法简单，操作方便，不需特殊仪器，不污染环境等优点，实为目前条件下可推广使用的一种可靠的TC定量检测手段。
　　2.TC酶试剂的推广应用
　　CEH COD的质量，价格及充足的来源是能否全面推广应用TC酶方法分析的关键，引进Boehringer CEH COD用甘油作保护剂制备胆固醇三联酶液，配制过程中在低温条件下用恒温磁力搅拌器混合，对酶的活性损失很少。三联酶液在-20℃低温下保存致少可稳定二年，在2～8℃环境中可稳定6个月。保证了酶试剂质量，降低了酶试剂成本。测定TC时显色反应在6分钟达到终点，血清TC浓度在12.7mmol/L以下线性良好；准确度试验平均回收率102.07％；精密度试验批内，批间CV≤2％；与BooRm am，Sclaro试剂比较P&>0.01无显著性差别，可代替进口试剂在自动生化分析仪上应用。由于制备过程中酶活性损失小，保证了酶试剂的价格，使胆固醇酶试剂在我省取缔了各级医疗机构的强酸显色剂，给我省的脂类测定标准化管理奠定了基础。