嘌呤类药物作用及巯基嘌呤甲基转移酶遗传多态性的分析进展

关键字： 嘌呤类药物
　　目前研究结果表明’治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的抗嘌呤代谢药物――6-巯基嘌呤(6-MP)和6-巯代鸟嘌呤(6-TG)均是无内在生物活性的药物’必须通过体内一系列代谢后才能发挥抗白血病效应。而人体一种被称为巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)的代谢酶在此类药物代谢和抗白血病作用中起关键作用。此酶是存在于哺乳动物和禽类细胞中的一种细胞内酶’非金属依赖性’能利用S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作为甲基的供体和底物结合’特异地催化杂环类和芳香类化合物苯环6-位硫原子的甲基化’其内在底物和主要的生物学功能仍然未完全清楚［1，2］，而其DNA编码顺序上某个核苷酸碱基点突变’是造成嘌呤类药物不同强度的细胞毒作用的基础［3］。所以’对于TPMT酶学特点、其遗传多态性的分子生物学机制以及6-MP、6-TG临床关系的研究成为当前研究药代动力学的热点之一。
　　1　6-MP和6-TG的代谢［4，5］　6-MP的代谢途径：①由次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)催化先形成硫基次黄嘌呤单磷酸盐(TIMP)’硫基黄嘌呤单磷酸盐(TXMP)’硫基鸟嘌呤单磷酸盐(TGMP)’后者经磷酸化后分别形成二磷酸盐和三磷酸盐。后三种物质统称为TGNs’它整合到肿瘤细胞中影响DNA的复制及RNA的表达’发挥抗肿瘤作用。②6-MP’TIMP’TGMP均可由TPMT催化生成甲基化的衍生物6-meMP’6-meTGMP’6-meTIMP’这些甲基化的化合物属于“无活性”的物质’它们能够抑制磷酸核糖焦磷酸化氨基转移酶(PRPP-AT)的活性’后者是细胞重新合成嘌呤步骤中的关键酶’因此’抑制PRPP-AT的活性就阻断了肿瘤细胞遗传信息的表达’从而达到抗白血病的作用。③由黄嘌呤氧化酶催化形成6-硫基黄嘌呤后再形成尿酸也可生成尿酸排出。
　　6-TG的代谢途径：①由HPRT催化直接形成硫基鸟嘌呤磷酸化合物(TGNs)发挥抗白血病作用。②也可由TPMP催化生成甲基化的产物如6-meTG’或me-TGMP’达到抗肿瘤的作用。但组织中TPMP对6-TG的催化效力远比6-MP低(约为1/12)［4］，故此过程并非6-TG的主要代谢途径。③6-TG由鸟嘌呤脱氢酶催化生成6-硫基黄嘌呤再由黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸排出。
　　2　TPMT的酶学特点
　　2.1　TPMT的组成结构：由两个具有相同的催化功能单体组成’说明TPMT的结构并非引起遗传多态性的原因。TPMT的分子量大约为30000。通过提取和分析人肾脏组织中的TPMT’发现它由245个氨基酸残基组成。另有人还发现几乎每个依赖SAM的甲基转移酶均含有3个结构保守的序列(motifⅠ，Ⅱ，Ⅲ)，分别含24-，12-，12-三个单体结构’估计这些序列为酶结合底物的结构域［6～8］。
　　2.2　TPMT的组织分布：人类TPMT首先在肝脏、肾脏中被发现’随后陆续地在胃肠道、肺、脑、血液、胎儿、胎盘等组织中发现。成年人肝细胞的TPMT浓度和血液组织中几乎呈直线相关。第3个月的胎儿即有TPMT的存在’其中第6个月的浓度及活性和新生儿类似’说明TPMT的浓度及活性在人体各组织内，甚至肿瘤组织中均存在密切相关性’测定红细胞中的TPMT浓度即可大致估计其它组织的酶活性［9’10］。
　　2.3　TPMT的酶学动力学特征：酶活性随孵育时间、底物浓度、pH值和离子浓度、底物浓度(红细胞浓度)的变化而变化［11］。TPMT最佳孵育时间为60分钟［10］’其它参数符合Michaelis-menten曲线。同时’Krynetski等［11］发现在一般组织中(肝、肾等)酶作用最佳pH值为7.5’而血液中为6.7。
　　2.4　TPMT的底物及抑制物：Krynetski等做了18种6-MP和6-TG衍生物的酶学实验’包括它们的核苷酸和核糖核酸’描述了它们的反应特性：大多数的衍生物均可作为TPMT的底物’它们的酶促动力学特性均符合Michaelis-menten曲线’发现6-MP比6-TG与酶结合的能力强。在所有前体药物(6-MP’6-TG)和衍生物中’8-羟基-6-MP和6-TG分别是两个药物家系中活性最大者’而它们的核苷酸盐类则是这些化合物中活性最低的’其原因可能是它们较易被水解。Mcleod等［10］发现当化合物中7’9位被烷基化后’其与酶结合的能力有所加强。同时发现前体药物的Km、Vm和Km/Vm值均比其衍生物低’说明6-MP和6-TG并非TPMT的自然底物。另外’6-硒基嘌呤(Selenopurine)及其衍生物也可以作为TPMT的底物’但是它们的Km和Vm值均显著比硫基嘌呤及其衍生物低。黄嘌呤8位上有-OH基者是底物，而2位上有-OH则为抑制物［12］。除2-OH-黄嘌呤外’S-腺苷-L-半胱氨酸、Sinefungin、6-甲基硫基嘌呤、3，4-双甲氧-5-对羟基苯甲酸为TPMT的抑制物［2］。
　　3　TPMT的遗传多态性　从人类T84结肠癌患者细胞中提取分析DNA及cDNA寡核苷酸探针筛查文库’发现TPMT基因总长为3.4kb’编码序列总长2.7kb’开放阅读框架含735个碱基。国外多个文献调查显示’大约有89%的人TPMT酶活性＞6U/ml pRBC’属于高活性’而11%的人酶活性为1～5U/ml pRBC’属于中度活性。而大约1/300的人活性低于1U/ml pRBC或其活性无法测出。造成这种结果的原因是编码TPMT的核苷酸碱基顺序发生点突变’而是否有染色体易位或丢失尚无文献报道。美国和英国学者已在白种人中发现和克隆出两个点突变位点’分别命名为TPMT*2和TPMT*3。其中前者是核苷酸序列中第238位的鸟嘌呤(G)→胞嘧啶(C)’使得氨基酸序列第80位的Ala(丙氨酸)→Pro(脯氨酸)’后者是第460位的鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A)’第719位的腺嘌呤(A)→鸟嘌呤(G)’结果是氨基酸序列第154位的Ala→Thr(苏氨酸)’第240位的Tyr(酪氨酸)→Cys(半胱氨酸)’这样就造成了酶活性的减低或丧失，从而导致在使用6-MP时形成高浓度的TGNs’引起明显的造血组织细胞毒性’产生严重后果’甚至引起死亡。两种突变类型中’TPMT*3出现的频率占两种类型的70%，而TPMT*2占30%［13’14］。 　　4　影响TPMT活性的因素
　　4.1　种族特异性：美国弗罗里达州黑种人平均TPMT酶活性为8.64±3.47U/ml pRBC’未发现缺陷患者。而白种人平均为12.3±3.88U/ml pRBC’酶活性的分布比例与前述类似［15］。Mcleod等［16］发现白种人的酶活性平均值为16.8U/ml pRBC’黑种人则为14.4U/ml pRBC(P＜0.001)。法国人平均15.4±7.0U/ml pRBC’其TPMT遗传多态性的分布和美国人相同［1］。新加坡的调查显示’健康华人中TPMT的多态性结论和美国人相似’而实际的数值却大大超过了国外报道的结果［17］。挪威Saami人的平均值为17.0±3.3U/ml pRBC’白种人为13.1±2.9U/ml pRBC(P＜0.001)’而酶活性的分布比例与前面结果相似［18］。同时’他们与韩国合作检测韩国人群的酶活性’其结果也类似［19］。
　　4.2　性别：3篇文献报告在白血病患者中女性的酶活性似比男性高’而健康人无明显差别［5，8，20］。其它的文献结果为无显著差异［2，3，17］。
　　4.3　年龄：文献提示TPMT的活性与年龄无相关性［9］。
　　4.4　红细胞寿命及免疫分型：无相关性［11］。
　　4.5　使用6-MP前后TPMT活性：患者在进行化疗时其体内TPMT的活性与用药前相比大约要上升30%’其中以用药前活性最低的患者上升得最快。而用药后约3个月又逐渐回到原来水平’其中下降得最快者是用药期间活性上升最高者［5，11］。
　　4.6　慢性疾病：无相关性［11］。
　　5　TGNs和TPMT的关系　TGNs和TPMT甲基化是嘌呤类药物治疗白血病的两个重要途径’它们之间的关系可以归结如下：高TPMT活性的人群形成的TGNs量少’甲基化产物多；低活性的人群形成的量多’甲基化产物少。因此’低活性人群TGNs虽然能产生强烈的抗肿瘤作用’但同时也容易产生毒副作用’引起造血组织的致命损伤；而高活性的人群由于体内的TGNs量少’虽然此副作用弱’但出现复发的机率也大［21］。
　　6　6-TG和6-MP的临床关系　由于6-TG直接衍生为TGNs’而且临床发现患者在使用6-TG时较少出现造血组织毒副作用及具较低复发性’因此’有人建议以它替代6-MP。但6-TG可引起门脉高压，与别嘌呤醇合用时引发较高的毒性’而且价格昂贵、半衰期短’所以目前临床医生建议和6-MP按需选择性交替使用［22］。此外’6-MP和6-TG的作用机制也稍有不同’前者作用于细胞周期的G1/S期’而后者作用于S/G2晚期’6-MP使嘌呤再合成受阻’而6-TG则使染色体“变性”’可能引起严重的治疗后期不良反应’故当患者酶活性低时可适当降低药物剂量’有文献报道将剂量降低90%时所产生的疗效和正常剂量无显著差异。另有文献报道酶活性低患者当降低6-MP剂量时如果和甲氨喋呤(MTX)联用可产生较好的疗效。其机制为抑制嘌呤合成后产生大量磷酸核糖焦磷酸盐’后者可以整合到细胞DNA中抗肿瘤。而当患者酶缺陷时应大规模减少剂量或选择换用其它药物。由于大多数患者在治疗前其体内TPMT活性未知’因此’在用药时较难避免造血组织毒性’加大了治疗的难度及影响疗效。此外’输血可能造成测定时的误差’应引起注意［23］。
　　7　研究嘌呤类药物和TPMT的意义　进行此项研究的意义在于：①测定6-MP原发性耐药个体’避免患者对药物不敏感’造成维持治疗期的复发’贸然加大剂量同时也易产生毒副反应。②测定TGNs浓度’避免高浓度时患者对药物过度敏感’产生造血组织抑制和肝脏损害’被迫终止维持治疗’使化疗不能长期、规则、正常地进行’从而容易复发。③避免由于造血组织的毒性使得全身免疫能力下降’产生继发感染’引发死亡或其它严重的反应。因此’认识中国人6-MP药代动力学’深入研究TPMT表现型和基因型’了解其遗传多态性的分布和机制’掌握药物代谢过程中的各种数据’就可针对每个患者不同酶活性和TGNs而制定相应的用药方案’使治疗个体化’提高急性白血病尤其是ALL的远期疗效乃至提高长期无病生存率。