关于神经降压素对帕金森病模型大鼠纹状体DA含量影响

【摘要】 目的 观察神经降压素(NT)对正常和帕金森病模型大鼠纹状体多巴胺(DA)及其代谢产物含量的影响。方法 采用6羟基多巴胺(6OHDA)单侧损毁内侧前脑束制备帕金森病大鼠模型。将5 μL 1 mmol/L NT或生理盐水双侧缓慢注入正常及帕金森病模型大鼠侧脑室30 min后，利用高效液相色谱分析(HPLC)法检测纹状体DA及其代谢产物高香草酸(HVA)和3，4二羟基苯乙酸(DOPAC)含量的变化。结果 正常大鼠NT组纹状体DA含量与生理盐水组相比均明显升高(t=5.32，P&<0.01)。帕金森病模型大鼠生理盐水组损毁侧纹状体DA含量与未损毁侧和正常大鼠生理盐水组相比明显降低(F=61.23，P&<0.001);损毁侧纹状体DA更新率(DOPAC+HVA)/DA、DOPAC/DA、HVA/DA均明显高于未损毁侧和正常大鼠生理盐水组(F=27.52、21.12、28.43，P&<0.001)。帕金森病模型大鼠侧脑室注射NT可明显提高两侧纹状体DA的含量(t=3.87、2.26，P&<0.05)。结论NT可增加正常及帕金森病模型大鼠纹状体DA的含量，提示NT具有抗帕金森病效应。
【关键词】 神经降压素;帕金森病;纹状体;多巴胺;色谱法，液相;大鼠
[ABSTRACT] Objective To observe the effects of neurotensin on striatal dopamine content in normal and Parkinsonian rats. Methods A rat model of Parkinson disease (PD) created by unilateral administration of 6hydroxydopamine (6OHDA) into the medial forebrain bundle. After bilateral intracerebroventricular administration of 1 mmol/L neurotensin or saline (5 μL)， high performance liquid chromatography (HPLC) was used to detect the content of dopamine and its metabolites: homovanillic (HVA) and 3， 4dihydroxyphenyl acetic acid (DOPAC). Results In normal rats， microinjection of neurotensin significantly elevated the concentration of dopamine in the striatum (t=5.32，P&<0.01). In PD model rats， the striatal dopamine level on the lesioned side was significantly decreased compared with that on the unlesioned side and normal rats (F=61.23，P&<0.01)， while the turnover ratio: (DOPAC+HVA)/DA， DOPAC/DA and HVA/DA were significantly increased (F=27.52，21.12，28.43;P&<0.001). Intracerebroventricular microinjection of neurotensin significantly elevated the striatal dopamine level on both sides of PD model rats (t=3.87，2.26;P&<0.05). Conclusion Neurotensin increases the dopamine level in striatum on both normal and PD model rats， which suggests that neurotensin may exert antiparkinsonian effects.
　　[KEY WORDS] neurotensin; Parkinson disease; corpus striatum; dopamine; chromatography， liquid; rats
　　帕金森病是人类一种常见的神经退行性疾病，主要病理改变是黑质纹状体通路多巴胺(DA)神经元渐进性的缺失。神经降压素(NT)是一种由13个氨基酸组成的肽类物质，广泛存在于中枢神经系统及胃肠道。已有实验证实，NT与DA共存于神经系统的许多部位，并且这两个系统相互影响，相互作用[1]。以往研究证实全身给予一种可以穿透血脑脊液屏障的NT类似物可以起到抗帕金森病的效应[2]，然而其作用机制仍不清楚。我们以往的工作证实，NT通过兴奋苍白球神经元从而改善帕金森病模型大鼠僵直的症状。本实验旨在探讨脑内NT对正常和帕金森病模型大鼠纹状体DA及其代谢产物含量的影响，为进一步阐明帕金森病的发病机制提供实验依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 动物 实验选用健康成年雄性Wistar大鼠 36只，体质量200～250 g，由青岛市药检所提供。大鼠置于室温(20±2)℃、24 h昼夜循环光照条件下生活，自由饮水、取食。
　　1.1.2 试剂及仪器 6羟基多巴胺(6OHDA)、阿扑吗啡(APO)、NT及单胺类标准品等，均购自美国Sigma公司。高效液相色谱仪为美国Waters公司产品。
　　1.2 方法
　　1.2.1 实验分组 实验共分4组：正常大鼠生理盐水(NS)组(n=9)，正常大鼠NT组(n=10)，帕金森病大鼠NS组(n=8)，帕金森病大鼠NT组(n=9)。
　　1.2.2 帕金森病模型大鼠的制备及旋转测试 从36只大鼠中随机抽取19只作为正常组，余17只大鼠用于制备动物模型。经腹腔注射80 g/L水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后，固定于脑立体定位仪上。参照Paxinos and Watson 大鼠脑图谱，将4 μL浓度为3.64 g/L的6OHDA溶液缓慢注入右侧内侧前脑束，坐标为：前囟后4.3 mm，旁开1.7 mm，颅骨表面下8.4 mm。注射速度1 μL/min，4 min内注完，停针10 min，缓慢拔针缝皮。术后腹腔注射10万单位青霉素钠预防感染。术后14 d，大鼠皮下注射0.2 mg/kg的APO，观察大鼠对侧旋转速度，旋转速度不小于7 r/min，30 min总数大于210 r为合格帕金森病模型大鼠。
　　1.2.3 给药方法 大鼠行水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位固定在脑立体定位仪上，充分暴露颅骨表面，使用三棱针在颅骨表面双侧侧脑室投射区域钻孔，参照大鼠脑图谱，坐标分别为：前囟后0.8 mm，旁开1.4 mm，颅骨表面下3.5 mm。将0.1 mmol/L的NT或NS双侧缓慢注入侧脑室，5 min内注完，停针10 min，缓慢拔针。
　　1.2.4 大鼠脑组织样品的制备 各组动物给药后30 min，快速断头取脑，在冰盘上迅速分离出两侧纹状体，样品准确称质量，加入样品预处理A液(即0.4 mol/L 高氯酸溶液)，冰浴中1 Hz超声10 s(即振动1 s，间歇1 s，反复4～5次)，将组织匀浆。冰浴静置1 h后，经12 000 r/ min 离心20 min，取其上清液加入预处理B 液(柠檬酸钾20 mmol/L、磷酸氢二钾300 mmol/L、乙二胺四乙酸二钠2 mmol/L)，涡旋混匀，冰浴静置 1 h，再于同一条件下离心20 min，取上清液置于-80 ℃低温冰箱贮存，待行色谱分析测定各样品组织的DA、二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的含量。
　　1.2.5 高效液相色谱测定 流动相含：柠檬酸63.5 mmol/L、柠檬酸三钠61.0 mmol/L、乙二胺四乙酸二钠0.1 mmol/L、八烷基磺酸钠0.65 mmol/L和0.8 mmol/L甲醇，pH 4.3，流量1.0 mL/min，设定工作电压为0.8 V。每次进样20 μL，根据色谱峰面积从标准曲线上求出其相应含量(μg/g组织湿质量)。
　　1.3 统计学处理
　　实验所得数据以±s表示，用F检验或者t检验行统计学处理。
　　2 结 果
　　2.1 NT对正常大鼠纹状体内DA及代谢产物含量的影响
　　正常大鼠NS组两侧纹状体DA及代谢产物含量差别无统计学意义(P&>0.05)。侧脑室微量注入NT后，纹状体DA、DOPAC和HVA含量与NS组相比分别增加32.70%、29.34%和7.36%。其中DA、DOPAC含量明显增加，差异均有显著意义(t=5.32、2.83，P&<0.01)。NT组两侧纹状体DA及代谢产物含量比较，差别亦无统计学意义(P&>0.05)。DA的更新率以(DOPAC+HVA)/DA、DOPAC/DA、HVA/DA表示，NT组HVA/DA与NS组相比降低22.2%，差异有统计学意义(t=2.45，P&<0.05)。见表1。
　　2.2 NT对帕金森病模型大鼠纹状体内DA及其代谢产物含量的影响
　　帕金森病模型大鼠NS组未损毁侧纹状体DA、DOPAC含量与正常大鼠相比均降低，差异有统计学意义(t=2.99、2.49，P&<0.05)，HVA/DA与正常大鼠相比升高105.56%(t=2.96，P&<0.01)。损毁侧纹状体DA含量与未损毁侧及正常大鼠NS组相比分别降低92.15%和94.98%(F=61.23，P&<0.001)。损毁侧纹状体内的DA更新率(DOPAC+HVA)/DA、DOPAC/DA、HVA/DA均明显高于未损毁侧和正常大鼠NS组，差异有统计学意义(F=27.52、21.12、28.43，P&<0.001)。
　　帕金森病模型大鼠NT组未损毁侧纹状体DA、DOPAC含量与帕金森病模型大鼠NS组同侧相比明显升高，差异有统计学意义(t=3.87、3.36，P&<0.05)，与正常大鼠NS组相比差异无统计学意义(P&>0.05)。NT组损毁侧DA、HVA含量与帕金森病大鼠NS组同侧相比明显升高，差异有统计学意义(t=2.26、2.27，P&<0.05)，但DA含量仍低于帕金森病大鼠未损毁侧及正常大鼠NS组。见表1。
　　3 讨 论
　　基底神经核是哺乳动物大脑皮质下的一组位置上相互靠近，并借大量神经纤维互相紧密联系的神经核团，对随意运动的起始和控制发挥重要作用。基底神经核内存在两条主要通路，纹状体整合来自表1 NT对正常和帕金森病模型大鼠纹状体DA及其代谢产物含量的影响大脑皮质以及其他外部传入的信息，通过直接通路和间接通路将信息传输给基底神经核的传出核团，从而影响丘脑和大脑皮质的兴奋性。纹状体棘突细胞的不同亚群表达不同的DA受体亚型。从黑质DA能神经元发出的纤维到直接通路的表达DA D1型受体的纹状体神经元，对直接通路起兴奋效应，通过纹状体GABA与P物质等抑制基底神经核输出核团，兴奋丘脑，最后起到易化运动作用。DA能神经元作用到间接通路的表达DA D2型受体的纹状体神经元，对间接通路起抑制作用，使纹状体受到抑制，因而兴奋苍白球外侧段，抑制丘脑底核，从而抑制基底神经核输出核团，兴奋丘脑，最后也起易化运动的作用。所以，DA能投射通过直接或间接通路，最后对运动都起易化作用[3]。正常情况下，这两个通路的活动在大脑皮质调控下处于复杂的平衡状态，可保证机体具有正常的随意运动功能，若这种平衡状态被打破则会导致多种运动功能障碍性疾病，如帕金森病。帕金森病是一种神经系统运动障碍性疾病，其特点主要是黑质致密带DA能神经元功能减退，从而引起纹状体DA含量降低。减少的DA通过作用到纹状体表达相应的DA受体的神经元，对直接通路和间接通路的易化和抑制作用减弱，使抑制性输出核团传出增加，大脑皮质兴奋性降低，从而导致运动减少等症状。由此可见，黑质纹状体DA系统与帕金森病的发病密切相关。此外，有报道黑质内Fe3+含量升高可使纹状体内DA释放量和含量均降低，铁含量高可能参与帕金森病的病理改变[4]。

　　NT是一种十三肽，在中枢神经系统，NT作为神经递质或者神经调质发挥重要作用。许多研究证实，脑内NT具有控制血压、痛觉、食欲和体温等作用，并且参与精神分裂症和帕金森病的发病过程[5]。形态学研究揭示脑内存在3种NT受体，即1、2、3型受体。在基底神经核，NT与黑质纹状体通路及纹状体苍白球通路密切相关，并通过其与DA神经系统的相互作用参与基底神经核对机体运动功能的调节。以往的研究显示，基底神经核NT表达与帕金森病发病有关。例如，正常机体黑质表达高水平的NT受体。然而，在帕金森病病人以及6OHDA制备帕金森病模型大鼠，黑质内NT受体表达明显降低[6]。在6OHDA损毁的大鼠，全身给予一种可以穿过血脑脊液屏障的NT类似物，可以产生抗帕金森病的效应[2]。然而，NT抗帕金森病的作用部位及机制尚不十分清楚。解剖学研究表明，苍白球接受来自纹状体发出的NT能纤维的支配。在6OHDA损毁的大鼠和帕金森病病人脑内，苍白球NT免疫反应性明显增强，该效应反映了机体的代偿机制[7]。我们以往的研究结果也提示，NT可通过提高苍白球兴奋性从而改善帕金森病僵直症状。此外，5羟色胺(5HT)也可通过影响苍白球神经元兴奋性产生抗帕金森病作用[89]。
　　除调节苍白球功能活动外，很多研究证实NT与DA递质系统密切相关。解剖学研究表明，大鼠90%以上的NT样免疫反应细胞与酪氨酸羟化酶和胆囊收缩素共存[10]。NT受体尤其是1型受体，在中脑有高密度的表达。腹侧被盖区和黑质网状带内近80%的DA神经元有NT受体表达。超过50%的NT 1型受体免疫反应性与DA D2受体共同存在于伏核外壳的胞体和树突上。NT 1型受体和DA D2受体共同存在于对称性GABA能突触，也存在于非对称性谷氨酸能突触。电生理研究显示，直接在腹侧被盖区给予NT可以通过NT 1型受体兴奋DA神经元。NT可以拮抗DA细胞内由DA引起的自身抑制现象，增加中脑DA神经元放电频率，促进末梢区域DA的释放[11]。同样，黑质内注入NT可以引起黑质DA神经元产生除极，并增加纹状体DA及其代谢产物的含量。
　　以往利用高效液相色谱分析法观察到侧脑室给予NT或NT受体激动剂可以增加纹状体DA及其代谢产物的含量[12]，这与我们实验中对正常大鼠观察到的结果一致。本实验进一步观察到6OHDA 损毁侧纹状体内 DA 及其代谢产物 DOPAC、HVA 的含量较未损毁侧及正常大鼠明显降低，提示DA的合成减少，损毁侧黑质致密带处于DA 耗竭或失代偿状态。但DA更新率(DOPAC+HVA)/DA、DOPAC/DA、HVA/DA与未损毁侧相比明显升高。由于从更新率的高低暗示神经末梢中释放的增减，我们认为损毁侧纹状体虽然总体释放量显著减少，但是功能幸存的单个末梢有代偿性的递质释放增强效应。众所周知，黑质致密带DA能神经元退行性变导致的纹状体内DA释放减少是帕金森病的主要病因。鉴于本实验观察到的NT可以增加帕金森病模型大鼠纹状体内DA的含量，我们推测脑内NT抗帕金森病的作用途径之一是通过作用于NT受体，从而促进纹状体内DA释放。
　　综上所述， NT可以增加正常及帕金森病模型大鼠纹状体DA及其代谢产物的含量。NT和DA相互作用是一个复杂的过程，NT抗帕金森病的详细机制还需要进一步探讨。
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