【摘要】 目的 观察17β-雌二醇（17β-E2）对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型脑细胞凋亡及血清sFas、sFasL水平的影响。方法 将7日龄SD大鼠75只随机分为假手术组、HIBD组以及HIBD+E2组，每组25只。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA法）分别测定血浆sFas、sFasL的含量，TUNEL法检测脑细胞凋亡率。结果 HIBD+E2组与HIBD组相比，CA1区的凋亡细胞数明显减少，尤其在24 h最明显；sFas、sFasL水平在各个时间点均明显降低，尤其在48 h最明显(F=2.37~21.02，q=2.32~8.34，P&<0.05、0.01)。结论 腹腔内给予17β-E2可明显减少HIBD模型鼠海马CA1区细胞凋亡，sFas、sFasL水平呈明显回降。
【关键词】 缺氧缺血，脑；雌二醇；细胞凋亡；抗原，CD95
［ABSTRACT］ Objective To study the effect of 17β-estradiol on cerebrocellular apoptosis of poxic-ischemic brain damage (HIBD) in neonatal rats， and on serum sFas， sFasL level in brain tissue. Methods Seventy-five 7-day old Wistar rats were evenly pided into sham-operation， HIBD and HIBD+E2 group. The number of cerebrocellular apoptosis was detected by HE and TUNEL and plasma sFas and sFasL measured by ELISA. Results In the intervention group， the number of apoptotic neurons was much fewer than that in HIBD group (P&<0.01)， and concentration of sFas and sFasL was much lower than that in control group， especially in 48 h (P&<0.05，0.01). Conclusion 17β-estradiol could inhibit neuronal apoptosis to protect neurons and attenuated brain injury after HIBD in neonatal rats. And the concentration of sFas and sFasL in the intervention group was lower than that of the control group.
［KEY WORDS］ Hypoxia-Ischemia， brain; Estradiol; Apoptosis; Antigens， CD95
新生儿缺氧缺血性脑病 (HIE)是新生儿常见且致残、致死率较高的疾病，其发病机制尚未完全明确。但已证实多种细胞因子参与了HIE的发病过程［1］。研究结果表明，HIE与细胞凋亡有关，17β-雌二醇（17β-E2）能有效地抑制海马区细胞的凋亡，但其具体机制不明。本研究在制备缺氧缺血性脑损伤（HIBD）新生大鼠模型的基础上，观察17β-E2对海马神经细胞凋亡的影响及HIE新生大鼠血清sFas、sFasL水平的改变，以探讨17β-E2在HIBD疾病中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
TUNEL试剂盒（Roche company，Germany）；sFas、sFasL定量ELISA试剂盒（上海森雄科技实业有限公司）；128C-340型酶标扫描仪（悦泰洋行）；CY-12C型便携式数字测氧仪（杭州梅城电化分析仪器厂）。
1.2 方法
1.2.1 实验分组 取7日龄SD雌性新生大鼠75只，随机分为假手术组（A组）、HIBD组（B组）及HIBD+E2（C组）组，各25只。每组又分为6、12、24、48、72 h等5个时段，每时段有5只动物。
1.2.2 HIBD模型制备 分离出左、右颈总动脉并结扎。空气中放置30~120 min后，将大鼠置于有机玻璃低氧舱内，维持氧体积分数在0.08(0.07~0.09)，舱内温度控制于（36±1）℃，湿度为70%±5%，持续3 h。假手术组：动物只游离两侧颈总动脉，但不结扎之，以消除手术及手术中应激的影响。
HIBD+E2组:手术前2 h腹腔注射17β-E2 100 μg/kg。各组在实验结束后于不同时间点自股静脉采血，分离血浆后，取大脑组织，置冰箱中保存待检。
1.2.3 血浆sFas、sFasL水平测定 采用双抗体夹心ABC-ELISA法。
1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡 按TUNEL试剂盒说明操作，计算阳性细胞凋亡率。
1.2.5 统计学处理 实验结果以x±s表示，用SPSS 10.0软件进行统计分析。多个样本均数的比较采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 HIBD后脑组织病理学变化
HIBD后6 h，海马出现少量凋亡细胞，表现为核固缩变圆，嗜碱性增强，核仁消失，并可见到凋亡小体；HIBD后12 h，可见海马内有少量神经细胞肿胀，细胞淡染，有核碎裂；HIBD后24 h，细胞凋亡达高峰，此时可见海马内有许多坏死细胞，嗜伊红深染；HIBD后72 h，海马CA1区神经元出现大量坏死。假手术组在各个时间点脑组织切片无明显的缺氧缺血改变。HIBD+E2组HIBD后24 h大鼠海马CA1区仅见少量神经细胞肿胀，细胞淡染，部分有核碎裂。
2.2 TUTNEL染色检查
阳性细胞为细胞核中出现棕色颗粒。镜下观察假手术组海马CA1区锥体细胞排列整齐，偶见POD阳性细胞，且在各个时间点大鼠海马CA1区凋亡细胞无明显差异(P&>0.05)。 HIBD后6 h海马CA1区开始出现凋亡细胞，24 h凋亡细胞显著增多，48 h达高峰后逐渐下降，但72 h仍高于假手术组(P&<0.01)。HIBD+E2组与HIBD组比较，海马CA1区凋亡细胞数在各个时间点均明显减少（P&<0.01），尤其在HIBD后24 h表现最明显。见表1。
2.3 血浆sFas、sFasL水平动态变化
假手术组血浆sFas、sFasL水平在各个时间点无明显差异(P&>0.05)。但HIBD后12 h血浆sFas、sFasL水平显著增高，48 h达高峰后逐渐下降，但HIBD后72 h仍高于假手术组(P&<0.05)。HIBD+E2组与HIBD组相比，血浆sFas、sFasL水平在12 h后的各个时间点均明显减少，尤其在48 h下降最为显著(P&<0.01）。见表2、3。
3 讨 论
表1 HIBD后各时间点大脑海马CA1区凋亡细胞率比较表2 HIBD后各时间点血浆sFas水平的变化表3 HIBD后各时间点血清sFasL水平变化HIBD的发病机制较为复杂，是否存在神经元细胞凋亡及其意义的研究尤为引人注目。目前研究己证明，在新生儿HIE中同时存在坏死和凋亡，而凋亡是迟发性神经元死亡的重要机制。蒋梨等［2］对新生HIE模型鼠实验表明，缺氧缺血后新生鼠脑细胞凋亡具有典型凋亡特征。孙桂莲等［3］研究结果显示，FasL蛋白在正常新生大鼠脑内弱表达，病变部位出现散在分布强阳性细胞，且多是凋亡细胞，表明FasL与脑细胞凋亡有直接的关系，同时发现缺氧缺血损伤后病变部位Bcl-2表达减弱，提示缺氧缺血损伤后Bcl-2与FasL的比例下降促进脑细胞凋亡。近年来研究认为，雌激素能保护HIBD。雌激素增高神经生长因子及其受体表达，抑制突触棘的减少，促进损伤的神经元修复［4］。有研究显示， 17β-E2能促进脑缺血后原癌基因bcl-2的表达，从而抑制细胞凋亡而起神经保护作用［5］。17β-E2对海马区DNA具有保护作用，能有效地抑制海马区细胞的凋亡。但雌激素在脑组织中的具体作用还有很多问题有待明确，其对脑组织作用的深入研究，将为HIBD、神经退行性改变、神经损伤等疾病的治疗提供理论依据。
本研究应用新生大鼠HIBD模型，观察17β-E2对脑细胞凋亡的影响及对HIE新生大鼠血清sFas、sFasL水平影响，进一步探讨17β-E2对HIBD的具体保护作用机制。本文实验结果表明，HIBD后6 h右侧海马CA1区出现凋亡细胞，24 h显著增高，于48 h达高峰后逐渐下降，但72 h仍高于假手术组。HIBD+E2组与HIBD组相比，CA1区的凋亡细胞数在各个时间点均明显减少，尤其在24 h最明显。表明该药可通过抑制神经细胞凋亡而对新生大鼠的HIE产生治疗作用。此外，本实验观察到，HIBD后24 h大鼠血清sFas、sFasL显著增高，48 h达高峰后逐渐下降，但72 h仍高于假手术组。HIBD+E2组与HIBD组相比，sFas水平在各个时间点均明显减少，尤其在48 h最明显。因此，17β-E2可能抑制由sFas、sFasL介导的细胞凋亡，起到对脑组织的保护作用。
【参考文献】
［1］张秋业，董燕妮，董增义. 新生儿缺氧缺血性脑病Th3功能的研究［J］. 青岛大学医学院学报， 2002，38(3):192-194.
［2］蒋犁，汤云珍，丁艳洁，等. 新生儿缺氧缺血性脑病模型鼠脑皮质、海马细胞凋亡的研究［J］. 江苏医药杂志， 2001，27(2):101-102.
［3］孙桂莲，韩玉昆. 实验研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时Bcl-2和Fas配体蛋白表达的研究［J］. 新生儿科杂志， 1999，14(6):752.
［4］MURPPY D， COLE N， GREEENBERGER V， et al. Estradiol increases dendritic spine density by reducing GABA neurotransmission in hippocampal neurons［J］. J Neurosci， 1998，18:2550-2559.
［5］DUBAL D B， SHUAGHRUE P J， WILSON M E， et al. Estradiol modulates bcl-2 in cerebral ischemia: a potential role for estrogen receptor［J］. J Neurosci， 1999，19(15):6385-6393.
转贴于