猪食管肌间神经节内PACAP免疫阳性神经末梢来源的初步研讨

【摘要】 目的 探讨猪食管肌间神经节内垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）免疫阳性神经末梢的来源。方法 采用荧光免疫组织化学技术及逆向神经元示踪技术。结果 猪食管肌间神经节内含有叶片状、PACAP免疫阳性的神经纤维网；经食管下括约肌腹侧壁行荧光素快蓝（FB）神经元逆向示踪研究显示，节神经节（NG）内含有许多FB示踪神经元，其中约有48％呈PACAP免疫阳性。 结论 猪食管肌间神经节内的PACAP免疫阳性神经末梢网很可能来源于迷走神经，为猪食管壁内的肌间神经节内板层样神经末梢。NG神经元顺向示踪研究结合免疫组织化学技术，将有助于确定此结构的形态特点并揭示其神经化学特征。
【关键词】 食管 神经节 神经末梢 免疫组织化学 猪
　　［ABSTRACT］ Objective To study the origin of PACAPimmunoreactive nerve fibers in myenteric ganglia of porcine esophagus. Methods Immunohistochemistry combined with retrograde neuronal tracing technique with fast blue was applied. ResultsDense leafletlike PACAPimmunoreactive nerve fibers were found in the myenteric ganglia of porcine esophagus， especially in the region of abdominal wall of lower esophageal sphincters; many fast bluetraced neurons were found in nodose ganglia， among which， about 48% were PACAPimmunoreactive. Conclusion The dense PACAPimmunoreactive nerve fibers found in the myenteric ganglia of porcine esophagus were possibly the intraganglionic lamina endings of vagal origin.
　　［KEY WORDS］ Esophagus; Ganglia; Nerve endings; Immunohistochemistry; Swine
　　以往研究表明，分布在上消化管壁内的中枢传入神经，包括迷走传入神经和脊髓传入神经，它们除参与消化管正常功能活动（如吞咽、胃排空及胃酸分泌等）的调控外，还很可能与许多消化管疾患（如胃食管反流及胃轻瘫等）的发病机制有关。其中的迷走传入神经末梢，形态上有多种表现形式，如肌间神经节内板层样神经末梢（IGLEs）、肌层内神经末梢网和黏膜内游离神经末梢等。IGLEs是消化管功能活动调节机制“迷走迷走反射环路”中的一个重要环节。近几年来对食管壁内的IGLEs的神经解剖学研究多集中于啮齿类，神经电生理学研究已证明豚鼠食管内IGLEs样结构具有机械感受器的特征，几乎所有这些结构均可被ATP所激活[1～3]。虽然大型哺乳类动物猪的食管组织结构与神经支配特点更接近人类的情况[4，5]，但对其食管壁内IGLEs的神经解剖学及神经电生理学研究，目前国内外尚未见报道。本研究旨在探讨猪食管肌间神经节内垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）免疫阳性神经末梢的来源，现报告如下。
　　1 材料和方法
　　取6周龄Landrace猪6只，性别不限。其中3只猪经50 μL/kg Hypnodil (Janssen Pharmaceuticals， Beerse， Belgium)腹腔麻醉、40 g/L多聚甲醛灌流固定后，取食管下括约肌（LES）组织，制成纵断面冷冻切片(16 μm厚)，用于荧光免疫组织化学观察。另3只猪作逆向神经元示踪实验，大体步骤如下：20 g/L荧光素神经元示踪剂快蓝（FB， Sigma， St. Louis， MO， USA）15～20 μL分别注射于食管LES腹侧壁不同部位内（每次1～2 μL）。术后1周，动物经麻醉，40 g/L多聚甲醛灌流固定后，取两侧NG制成冷冻切片(16μm厚)，荧光显微镜下查找切片中FB示踪神经元，然后结合荧光免疫组织化学染色方法，确定FB示踪神经元神经化学特性。荧光免疫组织化学方法一抗采用nNOS(Mouse，1∶1 000， Sigma)、血管活性肠肽（VIP，Mouse，1∶1 000， East Acres)、 PACAP（Rabbit， 1∶500， Peninsula)，分别对食管LES切片及含有FB 示踪神经元的NG切片进行不同组合的双重染色，二抗采用Goatantimouse FITC (1∶400， Jackson)、 Goatantirabbit CY3 (1∶5 000， Jackson)。对照采用去除一抗或用正常羊血清替代一抗的方法。标本在荧光显微镜（Olympus BX50）下观察，图像通过Adobe Photoshop5.5 software (Adobe Systems， San Jose， USA)进行处理。
　　2 结果
　　经食管下括约肌腹侧壁行FB逆向神经元示踪研究显示，在NG 切片中共观察到79个FB示踪神经元。 将含有FB示踪神经元的NG切片进行荧光免疫组织化学双重染色，发现其中38个神经元（约48％）呈PACAP免疫阳性，而且部分神经元胞体同时含有神经元性一氧化氮合成酶 (nNOS)免疫阳性物（图1）。
　　3 讨论
　　以往对大鼠与小鼠经NG进行顺向神经元示踪发现，迷走传入神经末梢IGLEs多聚集在上消化道，呈覆盖在肌间神经节表面板层样、叶片状分布的神经末梢网。本研究小组在研究猪食管的神经支配时观察到，正常猪食管壁肌间神经节表面也含有叶片板层样神经末梢网结构，此结构呈PACAP及VIP免疫阳性[4]，而啮齿类动物大鼠的相应结构却呈谷氨酸免疫阳性， 可见种属之间IGLEs结构的神经化学方面存在明显的差异。 经左侧NG远侧端迷走神经干切断术后，发现猪食管LES腹侧壁PACAP免疫阳性神经末梢网明显减少[4]。本实验经LES腹侧壁行FB逆向神经元示踪还显示，NG 切片中观察到约79个FB示踪神经元， 其中38个呈PACAP免疫阳性（约占48％），部分神经元同时含有nNOS免疫阳性物。综合上述结果可以初步推断：见于猪食管肌间神经节内的PACAP免疫阳性神经末梢网很可能来源于迷走神经，为猪食管壁内的IGLEs。为进一步确定此结构，下一步需要作NG顺向神经元示踪的研究。

转贴于 　　已有文献报道，种属之间在IGLEs神经化学特征方面存在着明显的差异。如钙离子结合蛋白Calbindin可以特异性免疫标记大鼠食管内IGLEs，但不能标记小鼠食管内IGLEs[6]。 因此，在确定了猪食管壁内的IGLEs形态、结构特点的同时，有必要进一步揭示其神经化学特征。目前，有关IGLEs神经化学特征方面的资料，主要来源于对大鼠及小鼠的研究。大鼠食管内IGLEs含有P物质(SP)，大鼠及小鼠食管内IGLEs还含有谷氨酸囊泡转运蛋白（VGLUT2）免疫阳性反应物[1，2]，说明大鼠及小鼠食管内IGLEs可能通过释放SP或谷氨酸，影响肌间神经元的活动。透射电镜观察结果进一步表明，IGLEs内所含的分泌囊泡多聚集在特化的细胞膜周围，提示IGLEs可能与周围肌间神经元之间形成突触样结构。另外，大鼠及小鼠食管内IGLEs均已证明具有ATP受体，即呈P2X2或P2X3免疫阳性。因此，IGLEs还可能作为化学感受器，感受某些神经递质（如ATP、乙酰胆碱等）从肌间神经元的释放。临床上常见的食管运动功能障碍，如吞咽困难与胃食管反流性疾病的发病机制，一直是人们亟待解决的问题[7]。有研究表明，分布在食管壁内的IGLEs可能与胃食管反流性疾病的发病机制有关。因此，研究确定大型哺乳类动物食管壁内的IGLEs形态结构及神经化学特征，将有助于进一步从理论上揭示食管运动的神经支配机制，促进临床上胃食管反流性疾病的深入研究。
【

参考文献

】
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