关于Thio-NADH酶法检测血清总胆汁酸的方法评价

作者：李顺康 钟方才 朱俊 王小平

【摘要】 目的 通过对方法学评价试验，选择一种检测血清总胆汁酸的方法。方法 Thio-NADH黄色发光系统酶循环法检测血清总胆汁酸。结果 本法线性达150mol/L，精密度，批内CV0.98％，0.85％，批间CV4.58％，4.13％，本法与普通酶显示法比较Y=0.903x-1.45 r=0.9955，n=50，配对t检验P＞0.05，胆红素＜830umol/L，血红蛋白＜50g/L，肝素钠＜100mmol/L，枸橼酸钠＜120mmol/L，乳酸＜30mmol/L，抗坏血酸＜280mmol/L，对测定结果无显著干扰。结论 本法线性好，精密度高，结果无明显干扰，对仪器管道、比色杯基本无色素沉着污染，是测定血清总胆汁酸的一种理想方法，值得推广应用。
【关键词】 酶循环法 血清总胆汁酸（TBA） Thio-NAD
　　本文采用无色素污染的Thio-NADH黄色发光系统酶循环法测定血清总胆汁酸，现将方法评价报导如下。
　　1 测定原理
　　血清中的胆汁酸（3α-羟类固醇）被3α-羟类固醇脱氢酶（3α-HSD）及β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)特异性地氧化，生成3-酮类固醇及β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型（Thio-NADH）。而生成的3-酮类固醇在3α-HSD及β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型（NADH）作用下，生成胆汁酸及β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型（NAD）。如此，血清中微量的胆汁酸在多次酶循环过程中被放大，同时可使生成的Thio-NADH扩增。在405nm测定Thio-NADH吸光度变化值，即得血清中胆汁酸的含量。
　　2 材料和方法
　　2.1仪器 日立7170-A全自动生化分析仪。
　　2.2试剂 四川迈克生物科技总胆汁酸检测试剂盒。
　　2.3方法 根据试验说明书编制测试参数，反应类型，速率法，反应温度37℃，波长405nm(主波)/660nm（次波）样品5ul，试剂Ⅰ215ul，试剂Ⅱ50ul，延迟时间1min，读数时间4min。
　　3 试验与结果
　　3.1反应动力学曲线 选择高、中、低三种不同浓度的血清样品，结果表明不同浓度的血清样品在反应开始1min内有延迟相，4min以后反应时间内均呈直线匀速反应，反应时间与灵敏度呈正比。 转贴于 　　 3.2线性 配制TBA含量为10，25，50，100，150umol/L的参考物，用本法测定，理论值（X）与测定值（Y）之间的线性回归Y=1.035x-0.54 r=0.9992，结果表明本法线性可达150umol/L。
　　3.3精密度 选择TBA含量为32.5umol/L和125umol/L的血清样品各一份，在日立7170-A全自动生化分析仪上重复测定20次，另将此二份样品每天测一次共测20天，结果批内CV分别为0.98％，0.85％，批间CV为4.58％和4.13％。
　　3.4方法比较 选择不同含量的临床血清样品50份，分别用本法（Y）和RANDOX的偶联黄递酶比色法试剂（X）测定，结果Y=0.903x-1.45 r=0.9955，配对t检验P＞0.05二者无显著性差异。
　　3.5回收试验 取一血清标本450u1加入50u1生理盐水作为基础样品，测定BTA浓度为5.87umol/L，向同体积血清样品中分别加入50u1，50umol/L和200umol/L标准物，使其加入浓度分别为50umol/L和20umol/L，每一浓度做平行管测定其含量。测定结果分别计算其回收率为96.7％和101.5％，平均回收率为99.3％。
　　3.6干扰试验 选择TBA含量为25umol/L血清一份，分别加入不同含量的血红蛋白标准液，乳酸，肝素钠，枸橼酸钠，用本法测定，结果表明，血红蛋白＜50g/L，胆红素＜830umol/L，肝素钠＜100mmol/L，枸橼酸钠＜120mmol/L，乳酸＜30mmol/L，抗坏血酸＜280mmol/L，上述浓度物质无显著干扰。
　　4 讨论
　　4.1血清TBA测定的酶循环法是一种通过脱氢酶-辅酶体系来循环底物的方法，该酶对Thio-NADH都应有高的亲和力，而且反应体系的pH和缓冲液应在允许正反应（底物氧化）和逆反应（底物还原）都能进行，而且还要求Thio-NAD和NADH浓度和比例适当，从而提高反应灵敏度。
　　4.2由于血清中TBA含量低，样品中存在干扰物质影响大，偶联黄递酶测定时，肝素钠、血红蛋白等干扰物质具有明显的负干扰，从而使结果出现负值，但该法则克服了此干扰的影响。
　　4.3偶联黄递酶比色法产生的甲色素具吸附作用，对仪器的管道、电磁阀、比色杯等具有明显的色素沉着污染，而本法则无此污染损害。
　　4.4本法线性好，精密度高，干扰试验表明几乎无干扰，是测定血清中胆汁酸的一种理想的方法，值得推广应用。
参 考 文 献
[1]Kaplan，IA，PesceA.Clinival chemistvy STLouis: Mosby.1984:605-606.
[2]杨昌国，许叶，吕邦太.血清总胆汁酸测定及临床应用.临床检验杂志，1997，323-327.