关于大鼠肝癌发生过程中Caspase3的表达及意义

作者：宁巍巍 刘同慎 李笑岩 王东 白咸勇

【摘要】 目的 探讨Caspase3在肝癌发生发展中的作用和意义。方法 应用免疫组织化学SP法，对二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌发生过程中Caspase3的表达进行了系统观察。结果 ①DEN诱发大鼠肝癌发生率为100%;②在正常大鼠肝脏、诱癌早期(1～8周)及诱癌中期(9～16周)可见少量肝细胞及枯否细胞呈Caspase3阳性表达，随着肝癌发生进程，Caspase3阳性枯否细胞数量增多，在癌结节中可见Caspase3阳性肝细胞，并且结节周边部比中央部阳性细胞多。结论 本研究表明肝细胞Caspase3的低表达和枯否细胞Caspase3的高表达可能与肝癌的发生和发展有关。
【关键词】 Caspase3;肝癌发生;免疫组织化学;大鼠
　　【Abstract】 Objective To investigate the expression of Caspase3 during hepatocarcinogenesis induced by diethylnitrosamine(DEN) in rats systematically.Methods The expression of Caspase3 was measured by immunohistochemical SP method. Results ①The incidence of hepatocarcinoma induced by DEN was 100%.②The expression of Caspase3 was detected occasionally in hepatocytes and Kupffer cells of normal rats and hepatoma rats with DEN treatment for 116 weeks.With the progress of hepatocarcinogenesis ，the number of kupffer cells expressing Caspase3 increased progressively，and the number of hepatocyes expressing Caspase3 in periphery of hyperplastic nodule was more than that in the centre.Conclusion The results suggest that the low expression of Caspase3 in hepatocytes and the high expression of Caspase3 are related closely to the development and progression of hepatoma.
　　【Key words】 Caspase3，hepatocarcinogenesis，immunohistochemistry，rat
　　Caspases即富含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶，是一与细胞凋亡相关的蛋白酶家族，它可激活细胞内的DNA酶，切割染色体DNA，直接导致细胞凋亡。Caspase3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者，作为细胞凋亡效应分子，参与细胞的生理及病理性死亡过程，是细胞凋亡研究的中心分子，肿瘤发生、发展的重要原因是细胞增殖与凋亡的动态平衡失调所致[1]。有研究报道Caspase3在许多正常人体组织和肿瘤组织中表达，但在肝癌发生过程中导致细胞凋亡功能低下的机制尚不明确[2]。本研究采用免疫组织化学方法检测了大鼠肝癌发生过程中Caspase3 的表达，旨在探讨Caspase3 在肝癌发生、发展中的作用和意义。
　　1 材料与方法
　　1.1 肝癌动物模型的建立和病理学检查 将150只雄性Wistar大鼠随机分为模型组(135只)和对照组(15只)。模型组饲以含二乙基亚硝胺(DEN，0.08‰)饮水，连续12周后改为自由饮水;对照组常规自由饮水。于实验第4、8、12、16、18、20、22、24、25周，随机选择模型组动物10～15只断头处死，大体观察和记录肝脏的形态、颜色、质地变化后，取肝组织，4%多聚甲醛缓冲液固定，常规石蜡包埋，进行3 μm连续切片，HE染色，光镜观察。
　　1.2 Caspase3免疫组织化学染色 兔抗大鼠Caspase3多克隆抗体购自北京博奥森公司，正常羊血清、兔二步法检测试剂盒购自北京中杉金桥公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司。采用SP法，主要步骤：3 μm组织切片常规脱蜡至水， 3%过氧化氢甲醇处理30 min灭活内源性过氧化物酶，柠檬酸缓冲液微波修复10 min，正常羊血清封闭30 min减少非特异性染色，滴加一抗4℃过夜，滴加二抗孵育30 min，DAB显色，冲洗，脱水，透明，封片。
　　2 结果
　　2.1 诱癌过程中大鼠肝脏的病理学变化 诱癌早期(1～8周)肉眼观未见明显异常。镜下肝细胞肿胀，部分肝细胞呈嗜酸性变。肝小叶结构尚完整，小叶内可见灶性坏死伴炎性细胞浸润。诱癌中期(9～16周)肝脏表面出现弥散分布的灰白色结节。镜下嗜酸性或透明细胞增生灶，并逐渐形成肝细胞增生结节，结节内细胞异型性较小。诱癌晚期(17～25周)肝脏表面布满大小不一的灰白色结节，切面可见出血和坏死。镜检为肝细胞肝癌，呈梁索状或团块状向周围组织浸润，癌周组织细胞水肿、嗜酸性变，并有肝细胞增生。
　　2.2 诱癌过程中Caspase3的表达 在正常大鼠肝脏、诱癌早期及诱癌中期偶见少量肝细胞及枯否细胞呈阳性表达(图1、2，箭头示枯否细胞)，随着肝癌发生进程， Caspase3阳性枯否细胞数量增多，在癌结节中可见Caspase3阳性肝细胞，并且结节周边部Caspase3阳性肝细胞较中央部多，胞质内可见棕褐色阳性反应颗粒(图3、4，箭头示枯否细胞)。 　3 讨论
　　Caspase家族是一大类凋亡调节基因，是哺乳动物细胞凋亡的启动者和执行者。根据Caspase在蛋白酶级联切割反应中的作用位置，分为在上游调控其它Caspase活化的始动Caspase (Caspase1、2、4、5、8、9、10 )和在下游直接介导凋亡实施的效应Caspase(Caspase3、6、7、14) ，其中Caspase3处于核心位置，发挥非常重要的作用，被称为死亡蛋白酶，它的活性受到抑制，就会引起细胞凋亡障碍，并有可能进一步引起肿瘤的发生和发展。有学者采用临床原发性肝细胞肝癌患者的病理标本，用免疫组化法检测Caspase3的表达进行研究发现，Caspase3在正常肝组织、肝硬化、癌旁肝组织及肝癌(HCC)组织中阳性率分别为87.5%、84%、85%及60.4%，Caspase3在肝癌组织中表达明显低于癌旁组织[1]，提示Caspase3的生物活性在肝癌细胞中受到抑制，导致肝癌细胞凋亡难以产生;并且发现Caspase3与HCC的分化程度明显相关，分化程度越低其表达越弱，提示Caspase3失表达在HCC发生发展过程中发挥重要作用[4]。另外，还有研究采用原位杂交法检测Caspase3在HCC中的表达发现39例HCC中的53.8 % (21例)不同程度地表达Caspase3，而46.2%的HCC未见Caspase3表达，HCC中Caspase3阳性率低于癌旁非癌肝组织中的阳性率，其表达与肿瘤的分化有关，中等至高分化的HCC中阳性率(72.2% )明显高于低分化HCC中的阳性率( 31.8% )，而与肿瘤的大小、分级无关[5]。这些研究大部分都是对临床原发性肝细胞肝癌患者的病理标本进行观测，而本实验采用免疫组织化学方法对DEN诱导的大鼠肝癌发生发展过程中Caspase3的表达的动态变化进行了观察。实验结果显示， 在正常大鼠肝脏、诱癌早期及诱癌中期可见少量肝细胞及枯否细胞呈阳性表达，随着肝癌发生进程， 在癌结节中可见Caspase3阳性肝细胞，并且结节周边部比中央部阳性细胞多，胞质内有棕褐色阳性反应颗粒。本结果提示，在新陈代谢比较旺盛的肝脏中，肝细胞和枯否细胞均可表达Caspase3。正常情况下，胞质中Caspase3以无活性的Caspase3酶原形式存在，只有当细胞发生凋亡时，才会变为有活性的Caspase3。
　　Caspase3处于凋亡途径的核心环节，在细胞受到刺激、损伤或接到死亡指令等信号时一旦被激活，即可启动凋亡。枯否细胞属于单核巨噬细胞系统，位于肝血窦，是体内定居于组织内的巨噬细胞中最大的细胞群体，是机体细胞免疫的重要组成部分，具有多种重要的生理功能，包括对细菌和病原体的吞噬作用，抗原处理及递呈功能，活化其他的效应细胞，对体内的肿瘤细胞尤其是肝癌细胞具有监视、抑制和杀伤作用[6]。本研究发现在诱癌晚期Caspase3阳性枯否细胞数量增多，这表明枯否细胞凋亡活跃，这可能是由于DEN的持续作用使枯否细胞受到损伤所致，枯否细胞凋亡的增加和癌变细胞的快速增殖，使枯否细胞与癌变细胞的比值下降，使得枯否细胞攻击突变细胞或肿瘤细胞、非特异性清除变性坏死肝细胞以及对肠道来的有毒物质的解毒能力均有所下降，从而进一步促进了肝癌的发生和发展。同时本实验结果提示，癌变肝细胞Caspase3表达水平低下，表明其凋亡功能低下，以导致其无限增殖、生长扩散。
　　近年基础研究发现，抗癌药物的疗效不仅取决于快速抑制肿瘤生长，亦取决于缓慢诱导肿瘤细胞凋亡[7]。鉴于目前肝癌化疗效果普遍不佳， 根据Caspase3 在肝癌细胞凋亡过程中可能存在的作用，我们认为可以考虑设计以Caspase3 为靶标的肝癌治疗方案， 以降低肝癌化疗的耐药性， 提高治疗效果。

参考文献

　[1] 王维利，孟刚.Caspase3与Survivin在肝细胞肝癌中的表达[J].安徽医科大学学报，2006，41(3)：278280.

　　[2] Howard Y，Chang HY，Yang X.Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases[J].Microbiol Mol Biol Rev，2000，64(6)：821846.

　　[3] 谢晶日，梁国英，李明等.益气活血化淤法对大鼠肝癌过程中Caspase3及组织学影响的研究[J].中医药信息，2009，26(1)：6869.

　　[4] 彭福森，谢文彪.Caspase3与肝癌细胞凋亡[J].社区医学杂志，2007，5(2)：5456.

　　[5] 张羽萍，华静.枯否细胞在非酒精性脂肪性肝病中的作用[J].国际消化病杂志，2008，28(4)：315317.

　　[6] 裴志东，杨致远，薛琪.低剂量PF方案持续注射治疗晚期肝癌的疗效观察[J].肿瘤基础与临床，2008，21(6)：487489.